郭乐乐 侯月洁 徐文靖

天津市儿童医院 300000

肾病综合征 (Nephritic syndrome, NS)是一种常见的免疫炎症性疾病，以大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿和高脂血症为特征的临床综合征，在儿童和成人肾小球类疾病中发病率分别为70%～90%和21%～31%[1]。临床治疗通常以糖皮质激素(GC)为首选药物[2]，因治疗需要应用激素量大、时间长, 易出现较多不良反应和并发症，如满月脸、高血压、糖尿病、骨质疏松等[3]。对口腔的副作用也逐渐受到关注：吸入治疗时可引发口腔白色念珠菌感染；正畸过程中糖皮质激素可影响牙齿移动的效率或矫治完成后的稳定性；通过影响骨的愈合和重建，引发骨质疏松，从而影响种植体的骨结合等[4-6]。另外有学者[7]发现口服皮质激素药物治疗的肾病患者牙周健康情况变差，提示牙周炎与肾病及糖皮质激素的应用之间可能存在关联。同时，糖皮质激素治疗肾脏疾病时患者体内IL-6及TNF-α含量增高，IL-6、TNF-α作为牙周炎时机体免疫应答产生的细胞因子，与牙周炎的发生密切相关[8]。牙周健康是口腔临床工作中的修复、正畸、种植等治疗的基础，本研究在肾病大鼠模型的基础上进行激素治疗，以IL-6及TNF-α水平为评价标准，旨在探讨牙周炎与肾病及糖皮质激素应用之间的相关性，为肾病患者的口腔治疗提供实验指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器:盐酸阿霉素(北京艾德莱生物科技有限公司)，注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(海正辉瑞制药有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)，大鼠IL-6及TNF-α ELISA试剂盒(美国eBioscience公司)。

1.1.2 实验动物分组及处理:60只SPF级健康、雄性WISTAR大鼠，体质量200～230g，饲养于中国医学科学院放射研究所动物实验室。适应性喂养1周，收集24h尿检测尿蛋白呈阴性后，随机分为两组：正常组、肾病组，每组30只。肾病组采用间隔1周2次尾静脉注射4mg/kg盐酸阿霉素，建立大鼠阿霉素肾病模型，正常组尾静脉注射等量生理盐水。注射完成4周后将造模大鼠共30只置于代谢笼内收集24h尿液，用BCA蛋白定量试剂盒检测尿蛋白；随后将两组大鼠各随机抽取10只处死，摘取肾脏制作病理切片。尿蛋白定量>100mg/24h，结合大鼠肾脏组织病理表现证明大鼠肾病综合征模型建立成功。剩余40只大鼠，随机将正常组20只分为空白对照组、糖皮质激素组，每组10只；肾病组20只分为阿霉素肾病组、阿霉素肾病+激素灌胃组，每组10只。糖皮质激素组及阿霉素肾病+激素灌胃组建模后给予甲泼尼龙30mg/(kg·d)灌胃，连续10周，1次/d，空白对照组及阿霉素肾病组给予等体积生理盐水灌胃。本研究中涉及内容均符合国家伦理原则，经医学伦理委员会批准实施。

1.2 样本采集

1.2.1 肾脏组织样本：阿霉素注射完成4周后，正常组及肾病组各随机抽取10只大鼠麻醉，摘取左侧肾脏组织，固定于10%甲醛中，用于制作病理切片。

1.2.2 龈沟液样本：各组灌胃10周后进行龈沟液样本采集，称取大鼠体质量按3ml/kg注射10%水合氯醛溶液，待大鼠麻醉后取其仰卧位，固定口腔，将大鼠右下颌第一磨牙颊面用无菌棉球擦拭，隔湿,干燥，将两根40号标准化灭菌纸尖分别插入隔湿的大鼠右下颌第一磨牙的(M1)近远中位点的牙周袋内，直至遇轻微阻力为止，静置15s后取出,合并置于含有1ml无菌PBS的EP管中(若纸尖上有血则弃之重取),-20℃冻存备用。

1.2.3 牙周组织样本：龈沟液样本采集完成后将大鼠处死，切取右侧上颌骨，保留磨牙及周围牙槽骨，置于10%甲醛溶液中固定，用于组织切片制作。

1.3 实验方法

1.3.1 24h尿蛋白定量：采用BCA蛋白定量试剂盒检测。

1.3.2 组织切片制作：将上颌骨标本置于10%甲醛溶液中，4℃固定1周，8%的甲酸溶液脱钙1周，60%、70%的酒精脱水各1h，80%的酒精脱水过夜，90%、95%、100%的酒精脱水各1h，65℃环境下浸蜡2次，各1.5h，石蜡包埋，在切片机上沿牙体长轴近远中向制作厚度为6μm的组织切片，HE染色。肾脏病理切片制作除去脱钙其余步骤同牙周切片制作相同。

1.3.3 龈沟液IL-6及TNF-α检测：由eBioscience公司提供的试剂盒，采用ELISA双抗体夹心法分别测定龈沟液中IL-6及TNF-α。严格按说明书操作，室温下将样本融化，加入蒸馏水重建大鼠IL-6标准品，每个反应孔各加入标准品或待测样品100μl，加入50μl生物素共轭物。室温下孵育2h，洗板。向所有微量孔内加入100μl抗生蛋白链菌素-HRP，室温下孵育2h，洗板。向所有微量孔内加入100μl TMB底物溶液，室温下孵育10min。每个微量孔快速加入100μl终止液，终止酶反应，使用分光光度计以基色波长450nm检测各个微量孔吸光度。采用TECAN sunrise 酶标仪，测得各检测孔吸光度值，按点到点绘制标准曲线，根据样本孔吸光度值求得样本浓度。TNF-α检测步骤同IL-6。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 空白对照组大鼠体重持续增长，皮毛光洁，饮食、尿量无明显改变。肾病组大鼠不同程度出现体重增长较对照组缓慢或下降情况，皮毛蓬松无光泽或有脏污，精神不活跃，其中以阿霉素肾病+激素灌胃组最为明显。

2.2 肾脏组织学观察 光镜观察：空白对照组无异常(图1a)，肾病组可发现肾小管内有较多蛋白管型，部分的肾小球系膜细胞呈轻度增生(图1b)，肾小球可见节段性硬化，囊壁可见增厚(图1c)。肾病组的病理表现与人类慢性肾小球肾炎和局灶节段性肾小球硬化类似，是不同肾病终末期的共同形态学表现，证明本实验所造模型为慢性肾病综合征模型，符合本实验要求。

2.3 牙周组织学观察 空白对照组结合上皮位于釉牙骨质界，牙龈牙周膜纤维排列整齐，无炎症反应，牙槽嵴顶无吸收(图2a)；糖皮质激素组沟内上皮和固有层可见炎细胞浸润，牙周纤维排列紊乱，毛细血管数目增多，扩张充血(图2b)；阿霉素肾病组牙周组织有少量炎症细胞浸润，牙周纤维排列稍有紊乱(图2c)；阿霉素肾病+激素灌胃组牙周纤维排列紊乱，牙槽嵴顶可见破骨细胞(图2d)。

a b c

a b

2.4 大鼠龈沟液IL-6及TNF-α水平 与空白对照组相比，其他三组大鼠龈沟液中IL-6及TNF-α含量均升高(P<0.05)，其中阿霉素肾病+激素灌胃组的IL-6、TNF-α明显高于其余三组(P<0.01)，糖皮质激素组与阿霉素肾病组的IL-6、TNF-α无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠龈沟液的IL-6及TNF-α含量比较

3 讨论

牙周病发病机制复杂，可从自身免疫反应、环境因素和系统性疾病影响等方面得以解释。越来越多的流行病学调查研究证明牙周炎与慢性肾病具有相关性，一项研究中，美国牙科协会列出与口腔健康相关的系统性疾病，其中便包括肾脏疾病[9]。目前，关于两种疾病相互影响的机制一些学者提出，牙周致炎因子在患者体内的循环水平提高，增加了系统性炎症的负担，体内IL-6含量增加，与肾小球系膜细胞表面IL-6受体结合刺激系膜细胞增殖，从而使肾小球病理变化加剧，引起肾小球组织结构及功能的异常，可能会导致肾病患者病情的恶化[10]。而包括TNF-α在内的肿瘤坏死因子可引起肾脏固有细胞增殖，刺激其表达黏附分子和其他炎症介质导致肾脏系膜细胞的损伤进而促使肾病的恶化。慢性肾病患者针对包括IL-6和TNF-α在内的致炎因子表现出活跃的系统性炎症反应，体内IL-6、TNF-α含量增加，并且经过牙周基础治疗后，炎症因子的水平明显下降[11]，表明牙周炎与慢性肾病有一定的相关性。

IL-6作为炎性因子的一种与牙周炎有密切的关系：针对炎症刺激诱导一系列反应，并且控制其他细胞因子的表达，如IL-1、IL-10、TNF-α等；通过影响龈下菌群的组成、增加牙周致病菌定植的敏感性在革兰阳性菌引起的炎症反应中发挥重要作用[12]；促进牙槽骨的吸收，诱导破骨细胞前体转化为成熟的破骨细胞促进骨基质的降解。此外，IL-6具有抑制牙槽骨吸收后新骨的形成；Moreira等[13]发现，IL-6的表达量与牙周附着丧失有密切关系。以上均证明IL-6参与牙周炎的发病机制。TNF-α是由单核巨噬细胞产生的一种低分子量蛋白质，通过诱导成骨细胞、牙周初代细胞、T细胞和牙周膜细胞，增强人破骨细胞活性进而促进牙槽骨吸收，增加基质金属蛋白酶的产生，导致胶原纤维的破坏，刺激基质细胞的凋亡，限制牙周组织的修复等。TNF-α的浓度与牙周炎的病程密切相关，在牙周病发展过程中加重炎性反应，促进牙槽骨破坏[14]。

实验结果中发现肾病综合征大鼠龈沟液中的IL-6及TNF-α含量高于空白对照组大鼠(P<0.05)，与国外研究报道相符[15]。表明肾病综合征可造成牙周致炎因子的升高，可能会引发或加重牙周炎，造成牙周病的潜在威胁，并且牙周组织切片中肾病综合征组有轻微的炎症表现，共同证明肾病综合征可造成牙周的炎症。有研究发现由肾病引发的炎症反应可对牙周组织产生危害，加重牙周疾病的程度，引起牙槽骨、牙龈、牙周膜和牙骨质等牙周组织的病理性改变[16]。临床观察得知大约90%的慢性肾病患者出现牙周异常的症状，较正常人群牙周状况差，并且经过牙周非手术治疗后，牙周情况普遍好转。我国传统中医认为齿为肾之标，肾气盛则齿更发长，牙齿浮动多为肾气虚衰、牙齿失荣导致，肾脏疾病是牙周炎发病的主要因素，并且通过补肾药物配合牙周基础治疗对牙周炎的疗效显著[17]，更加验证本实验结论。

近年来，内分泌与牙周炎的相关性受到人们的关注，从而提示糖皮质激素与牙周炎之间有一定的联系[18]。本文结果显示，糖皮质激素组大鼠龈沟液中的IL-6及TNF-α含量高于空白对照组大鼠(P<0.05)，且与阿霉素肾病组的IL-6、TNF-α含量无统计学差异(P>0.05)，同时糖皮质激素组牙周组织病理切片中表现出轻度炎症，表明糖皮质激素的应用可能会引起牙周炎症。而李生娇等[19]通过制造牙周炎大鼠模型并给予激素皮下注射发现单纯的糖皮质激素失调并不能引起牙周炎的发生，但却可以加重牙周炎的严重程度，该学者观点与本实验略有差异，推测可能是由于激素灌胃时间短及剂量不同所导致，该差异造成的原因还有待进一步实验研究。

本文结果显示，阿霉素肾病+激素灌胃组大鼠龈沟液中IL-6及TNF-α的含量高于阿霉素肾病组(P<0.05)，并且阿霉素肾病+激素灌胃组的组织切片中炎症反应较阿霉素肾病组更严重，且出现破骨细胞。表明在肾病综合征的基础上糖皮质激素治疗可引起大鼠龈沟液中的致炎因子含量的升高，加重牙周组织的炎症反应，与之前的研究结果较为一致。

综上所述，阿霉素肾病大鼠本身存在牙周异常，肾病与牙周病之间存在一定的相关性，在肾病基础上使用大剂量糖皮质激素治疗后会使大鼠牙周异常加重。本实验结论为进一步研究牙周炎与肾病及糖皮质激素应用之间的关系提供了理论和实验基础，并且对临床肾病综合征患者的激素治疗方案和牙周炎的预防、治疗具有一定的指导意义。但本实验研究样本小，检测指标较少，结论有一定的局限性，仍需进一步的实验研究和临床验证。