李钰华 黄杰 姬晓伟 费嘉 于婷★ 黄以宁★

地中海贫血是珠蛋白基因缺陷导致的一种溶血性疾病，为全球分布最广、携带/发病人群最多的一种常染色体单基因遗传病［1］。在中国，地贫多发于广东、海南等南部沿海地区［2］，以α型和β型最为常见，编码ɑ-珠蛋白的HBA基因和编码β-珠蛋白的HBB基因的突变和缺失是导致地中海贫血的直接原因。胚胎植入前单基因病检测技术（Preimplantation Genetic Testing for Monogenic，PGT-M）通过检测致病基因区域上下游一定范围的遗传学标志物，结合家系成员之间的遗传学关系及致病基因携带情况，构建单体型以区分致病和正常胚胎，避免将携带致病基因的胚胎移植入母体。早期单体型构建主要采用PCR 法扩增与致病基因座连锁的生物标记物［3-4］，但通量低、灵活性差、易受等位基因脱扣（allele dropout，ADO）的影响［5-6］，位点附近如发生重组时易引起误诊。随着高通量检测技术［7-9］的发展，二代测序（Next generation sequencing，NGS）和基因芯片已逐步应用于PGT-M。本研究拟对一种NGS 地贫panel 和全基因组SNP（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片试剂的检测性能进行评价，为胚胎植入前地中海贫血检测选择适宜的方法提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 胚胎植入前地中海贫血诊断国家参考品

批号：360027-201901，由中国食品药品检定研究院研制并提供，包含4 个地中海贫血家系20 份样本。参考品原料系以人全血建立的永生化细胞系和永生化细胞系提取的DNA，适用于对父本、母本、和（或）先证者以及胚胎检测。

1.2 主要试剂

DNA 定量试剂（Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit，美国ThermoFisher 公司），核酸纯化磁珠（AMPure XP 磁珠，北京中仪康卫医疗器械有限公司），SNP 芯片试剂盒（Infinum Assay Kit，美国illumina公司），单核苷酸多态性微阵列芯片（Human CytoSNP-12v2.1，美国illumina 公司），单细胞全基因组扩增试剂盒（Discover-sc®Single Cell WGA Kit，南京诺唯赞生物科技有限公司），多重靶向扩增试剂盒［MultipSeq®Custom Panel，艾吉泰康生物科技（北京）有限公司］，测序反应通用试剂盒（MiSeqTMDx Reagent Kit v3，美国illumina 公司）。

1.3 主要仪器

SNP 芯片扫描仪（型号：iScan，美国illumina 公司），Life ECO 基因扩增仪（型号：TC-96/G/H（b）C，杭州博日公司），高通量测序仪（型号：Miseq，美国Illumina 公司）。

1.4 NGS panel 及全基因组芯片试剂盒位点分析

市售用于胚胎植入前地中海贫血基因检测的试剂盒包括：基于NGS 方法的地贫panel、基于全基因组SNP 的芯片试剂盒。文献中［5，6，8］进行胚胎植入前单基因病遗传学检测的全基因组SNP 芯片主要来源于illumina 公司，其芯片产品包括：HumanCyto-12、ASA 芯片、GSA 芯片。分别对3 款芯片及NGS panel 的SNP 位点设计数量、最小等位基因频率进行统计分析，评估NGS panel 和全基因组SNP 芯片试剂盒的检测性能。

1.5 试验方法

国家参考品中4 份模拟胚胎样本（含3～5 个细胞）采用单细胞全基因组扩增试剂盒进行多重置换扩增，产物定量后与gDNA 样本进行后续检测。按照SNP 芯片试剂盒说明书操作步骤，对参考品进行处理和芯片杂交，芯片包被后通过iScan扫描仪扫描获得数据。

同时样本按照MultipSeq®Custom Panel 文库构建流程进行文库制备，文库经稀释混合变性后，在Miseq 高通量测序仪上进行测序。将iScan 和Miseq 下机数据上传至嘉宝仁和公司PGX Cloud 云平台进行数据分析，选取HBA和HBB基因及上下游2 Mb 范围构建单体型，并统计有效位点数量。

2 结果

2.1 NGS地贫panel和全基因组SNP芯片位点评估

除HBA基因上游外，所有类型芯片在其它位置设计的SNP 位点数量均大于NGS panel。见表1。ASA 和GSA 所设计的位点最小等位基因频率（Minor allele frequency，MAF）集中在0-0.1，与NGS 地中海贫血panel 及Cyto-12 芯片相比偏低。见图1、图2。

表1 目标区域位点数量Table 1 Number of loci in target area

图1 HBA 基因上下游位点MAF 值分布Figure 1 Distribution of MAF values of upstream and downstream loci of HBA gene

图2 HBB 基因上下游位点MAF 值分布Figure 2 Distribution of MAF values of upstream and downstream loci of HBB gene

2.2 数据质量

基因组DNA 样本数据质量良好，4 个模拟胚胎活检样本质控参数的质量偏低，尤其是30 X 覆盖度（58.71%～88.50%）和SNP 检出率（0.595 9～0.701 1）。见表2。

表2 数据质量参数Table 2 Data quality parameters

2.3 HBA 有效位点结果

2 种方法在HBA基因上游2 Mb 范围内获得2个以上有效位点，但均未在基因下游0～1 Mb 范围内检测到有效位点。在HBA基因下游1～2 Mb 范围内，除4 号家系男方样本两种方法均未获得有效位点外，NGS 地贫panel 在其它样本上获得的有效位点数总体多于SNP 芯片，在1 号家系中，NGS 地贫panel 检测到了短串联重复序列（Short tandem repeats，STR）位点。见表3。

表3 HBA 基因SNP 有效位点Table 3 SNP effective loci of HBA gene

2.4 HBB 有效位点结果

两种方法均能在HBB基因上下游各2 Mb 范围内获得2 个以上有效位点。见表4。

表4 HBB 基因SNP 有效位点Table 4 SNP effective loci of HBB gene

2.5 单体型构建及家系分析

以1 号、4 号家系的NGS 和芯片数据构建的HBA和HBB家系单体型结果见图3、图4。两种方法构建的胚胎单体型结果与国家参考品标明的致病性位点遗传关系一致，但由于SNP 芯片在1 号家系男方HBA基因下游无有效位点，因此不能排除胚胎在HBA基因下游区域的重组风险。见表5。

表5 单体型构建结果一致性Table 5 Consistency of results for haplotype construction

图3 1 号家系HBA 基因家系关系图Figure 3 genealogical tree of HBA gene in family 1

图4 4 号家系HBB 基因家系关系图Figure 4 genealogical tree of HBB gene in family 4

备注：F0 表示男方风险染色体，F1 表示男方正常染色体，M0 表示女方风险染色体，M1 表示女方正常染色体，图4 同。

3 讨论

全基因组SNP 芯片和NGS 法均为高通量检测技术，芯片法优势在于通用性和一体化，在进行单基因病检测的同时给出染色体非整倍体信息［10］，而胚胎植入前非整倍体筛查（Preimplanation Genetic Testing for aneuploidy，PGT-A）的加入与单独的胚胎植入前单基因遗传学检测（preimplantation genetic testing for monogenic，PGT-M）周期相比妊娠率显著增加（68.4% vs 45.4%）［11］。NGS 法从检测成本考虑，全基因组测序的深度及分辨率不足以实现大多数单基因病的检出［12］，需通过多重PCR 靶向扩增，对目标区域富集后检测以达到较高测序深度，其缺点在于需针对每一种单基因病定制靶向富集引物，且无法同时给出PGT-A 检测结果。但对于基因组的特殊区域（如端粒区），NGS 方法表现相对灵活，可根据实际情况添加或删除检测位点，因此在解决部分疑难病例上更有针对性。

本研究首先筛选了适用于进行胚胎植入前地贫检测的试剂盒，其中NGS panel 在千人基因组数据库中筛选最小等位基因频率大于等于0.1 的SNP 位点，去除含有多聚核苷酸及上下游100 bp范围内GC 含量大于70%的SNP 及STR 位点。针对SNP 芯片方法，分析了3 款芯片（ASA、GSA、Cyto-12）参数，前两者位点数量较多，但位点MAF值偏低，且定位于全基因组关联分析研究，大部分位点为低频位点，不适合用于胚胎植入前单基因病遗传学检测；而Cyto-12 芯片位点MAF 值较其他芯片更高，应用相对成熟，已有文献报道广泛应用于胚胎植入前遗传学检测和产前诊断［13］。

地中海贫血国家参考品样本来源清晰，突变位点均已确认，故用于对NGS panel 和SNP 芯片试剂盒进行评价。有效位点统计结果表明，HBA基因上游2 Mb 范围内，两种方法均能获得足够的有效位点，但在基因内部和下游2 Mb 范围内有效位点数量大幅减少，在HBB基因上下游2 Mb 范围内，NGS panel 和Cyto-12 芯片试剂盒均获得足够的有效位点。由于HBA基因下游靠近16 号染色体端粒，端粒区域多为高度重复区域，不利于探针和引物的设计。对于芯片来说，探针设计时为提高探针杂交成功率和准确性，除需满足类似于NGS panel 引物设计的条件外还需满足其它条件：例如探针60 bp 范围内不能存在未测明的N 碱基，25 bp 内不能存在其它SNP 位点等，这导致对于基因组特殊区域来说，芯片的多家系适用性降低。单体型构建结果表明，针对HBA基因，芯片在1 号家系男方样本的基因下游未获得有效位点，因此不能排除基因该侧在胚胎中的重组风险。而NGS panel 在该区域能够获得足够的有效位点，且同时在1 号和3 号家系中检测到了STR 位点，因此可给出胚胎致病性的明确判断。STR 是PGT-M 检测中常见的遗传标志物之一［14］，单个STR标志物的信息含量相当于3 个SNP［15］。采用SNP+STR 标志物的方式能够增加排除胚胎染色体重组的灵敏性，提高家系单体型分析的可靠性。

综上所述，在地中海贫血国家参考品HBB基因家系分析中，采用NGS 地中海贫血panel 和全基因组SNP 芯片均可给出基因致病性判断，但对于HBA基因，SNP 芯片在部分家系中由于有效位点不足无法排除胚胎重组。说明该芯片针对HBA基因胚胎植入前检测存在一定风险，应谨慎选择，建议针对特殊区域采用NGS 法构建单体型，提高临床检测效率。