马春蕾，汪继伟，魏杨建，陈 雄，李 沛，李 库，熊 建，李 欣,*

（1.发酵工程教育部重点实验室，湖北省工业微生物重点实验室，湖北省工业发酵协同创新中心，湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；2.安琪酵母股份有限公司，酵母功能湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443000）

酵母抽提物是一种采用现代生物技术将酵母中的蛋白质、核酸等大分子降解为核苷酸、肽、氨基酸等小分子物质后精制而成的一种天然酵母制品[1-2]。酵母抽提物中含有糖类、维生素、有机酸、肽、核苷酸等，是天然的营养鲜味和增味剂，被广泛用作调味剂[3-4]。其中，酵母抽提物呈现丰富的风味物质，如酮、醛、酸、醇、呋喃、吡嗪、噻唑和萜烯类等芳香活性化合物[5-8]。然而，存在于酵母抽提物中的酵母味并未被广泛接受。众多研究表明酵母抽提物中的酵母味主要由挥发性风味化合物导致，如甲酚、吲哚[9]、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、正辛醛、苯乙烯、邻二甲苯、糠醇[10]、3-甲基吡啶[11]等。酵母味的存在一定程度影响了酵母抽提物应用的广泛性。目前，除了对工艺流程进行适当的调整和优化（热处理、高压均质、氨基酸和铵盐添加等[12-15]）以达到减弱酵母味形成外，去除或掩盖酵母味的研究鲜有报道，且上述方法具有能耗大、去除酵母味的同时未改善酵母抽提物风味等不足之处。因此开发新型去除或掩盖酵母味的技术具有重要意义。

乳酸菌作为一类益生菌被广泛应用于生产各种发酵食品，通过激活一些次级代谢途径，形成风味化合物和典型结构，提升产品的风味和质地，减轻其中不良风味[16]。不同种类乳酸菌的风味代谢不同，从而导致不同乳酸菌作为发酵剂制成的产品具有差异性，如植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）主要存在于乳制品中，乳酸链球菌（Streptococcus lactis）与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）多存在于奶酪[17]。同时，菌种差异和发酵方式的不同也能影响发酵食品的风味[18]。混菌发酵不仅能丰富发酵食品的风味[19]，还能防止产品异味和酸败的形成[20]。除此之外，不同种类乳酸菌混菌发酵体系下，复杂的微生物菌群相互促进混合微生物中所含单一乳酸菌的特定风味化合物代谢的同时[21]，也能获得具有创新成分的潜在食品发酵剂[22]，改善发酵产品品质。目前，乳酸菌发酵去除酵母抽提物酵母味的研究鲜有报道。可见，在微生物发酵去除酵母抽提物酵母味的研究中，乳酸菌是一类值得高度关注的微生物。

本研究基于3种乳酸菌为发酵剂，单菌或混菌发酵酵母抽提物，通过比较分析发酵后酵母抽提物的风味、呈味和氨基酸等指标，探索不同发酵体系对酵母抽提物酵母味去除和品质改善的效果和差异性，旨在为后期研发新型酵母抽提物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母抽提物FG10由安琪酵母股份有限公司提供。乳酸链球菌、植物乳杆菌ATCC8014和乳酸乳球菌CICC6242分别来自实验室保藏、北京生物保藏中心和中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 仪器与设备

HNY-211B恒温培养振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司；CJ-2D型无菌操作台 天津市泰斯特仪器有限公司；SPX-150D型恒温生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Ultimate 3000高效液相色谱仪美国赛默飞世尔科技公司；7890B气相色谱仪 美国安捷伦公司；SBA-90生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所；Milli-Q Plus超纯水系统 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1种子活化

取于-80 ℃冰箱中保存的菌种甘油管1 mL接种于装有50 mL/250 mL的液体种子培养基（De Man Rogosa Sharpe培养基）中，37 ℃培养箱中静置培养24 h后，再将培养后的菌液接种于新的液体种子培养基中，于37 ℃培养箱中静置培养24 h进行二级活化，得到种子液。

1.3.2 发酵培养基及发酵方法

发酵培养基为酵母抽提物（FG10）50 g/L、蔗糖30 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L。用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH 7.0后115 ℃高压灭菌20 min。

7种发酵体系分别为：乳酸乳球菌单菌发酵（R）；乳酸链球菌单菌发酵（L）；植物乳杆菌单菌发酵（Z）；乳酸乳球菌和乳酸链球菌两菌发酵（R+L）；乳酸乳球菌和植物乳杆菌两菌发酵（R+Z）；乳酸链球菌和植物乳杆菌两菌发酵（L+Z）；乳酸乳球菌、乳酸链球菌和植物乳杆菌三菌发酵（R+L+Z）。

两菌发酵或三菌发酵均遵循同步接种，且接种比例为1∶1或1∶1∶1。所有发酵过程均在相同的参数下完成，包括发酵温度30 ℃、发酵转速200 r/min、装液量50 mL/250 mL、发酵周期24 h，取样点6、12、24 h。接种量控制二级活化种子总菌液OD600nm值在0.2左右后接种于无菌发酵培养基中。

1.3.3 风味物质的测定

样品处理方法：取5 mL样品，加1.5 g氯化钠，再加1 µL内标邻二氯苯（0.1 µL/mL）于50 ℃磁力搅拌器上加热平衡30 min后，将萃取头插入样品瓶顶空部分，50 ℃萃取30 min。将萃取头插入气相色谱仪进样口，进样口温度250 ℃解吸5 min后进行气相色谱分析[23]。

色谱条件：色谱柱为安捷伦INNOWAX柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm），起始温度40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升温到240 ℃，保持8 min。汽化室温度为250 ℃，载气为氮气，柱前压为20.704 psi，恒定流量为6.5 mL/min；不分流进样，溶剂延迟时间为1.5 min[10]。

1.3.4 呈味物质的测定

乳酸和谷氨酸均用生物传感仪测定；核苷酸的测定参考GB/T 23530—2009《酵母抽提物》。

1.3.5 氨基酸的测定

将12 000×g离心5 min后的样品（500 µL）用氯甲酸乙酯衍生化后[24]，用气相色谱（火焰离子化检测器和色谱柱DB-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm））进行氨基酸浓度的测定。柱温设定为70 ℃保留5 min，然后以5 ℃/min上升到280 ℃，保留5 min；进样口温度设定为280 ℃，检测器温度设定为300 ℃；载气为氮气。

1.3.6 感官评定

感官评定由来自湖北工业大学的12 名感官评价员（6 男6 女，年龄20～40 岁）完成。参考ISO 8586：2012，在感官室（室温（25±2）℃）中被挑选和训练，并且都有一年以上对酵母抽提物的感官评价经验。描述酵母抽提物特性的术语由评价员在评估一些样品和参照资料后共同提供[11,25]，风味评分主要基于4个项目：酵母味、酱香味、酸味和异味。参考GB 10221—2021《感官分析 术语》建立评分标准，评估员使用10分制（0～3，弱；4～6，中等；7～10，强）通用强度量表表征嗅评强烈程度。样品（样品供应温度（37±2）℃）由小组成员一式三份进行嗅评打分，然后取平均值作为风味评价的结果。

1.4 数据分析

所有实验均进行3次重复平行实验。主成分分析（principal component analysis，PCA）和显著性分析（P＜0.05，差异显著）使用IBM SPSS Statistics 23.0软件。气相色谱检测物和高液相色谱检测物分别采用内标法和外标法进行定量，根据标准品出峰时间确定相对保留时间进行定性。图像制作使用Origin软件。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌在酵母抽提物中的生长分析

如图1所示，3种乳酸菌在发酵培养基中均能生长，且具有差异性。乳酸乳球菌（R）在酵母抽提物中生长最佳，发酵12 h后达到生长稳定期，OD值稳定在9.79左右。植物乳杆菌（Z）在整个发酵周期处于持续生长状态，生长速率略低于乳酸乳球菌，27 h生物量与乳酸乳球菌（R）达到一致水平。乳酸链球菌（L）在酵母抽提物发酵培养基中生长活性最低，发酵24 h生物量稳定在OD600nm值为8.34左右。

图1 乳酸菌在基于酵母抽提物的发酵培养基中的生物量变化Fig. 1 Biomass changes of lactic acid bacteria cultured in fermentation medium based on yeast extract

上述3种乳酸菌在基于酵母抽提物为主要营养的发酵培养基下均能生长，且乳酸乳球菌（R）和乳酸链球菌（L）在24 h后均达到生长稳定期，因此3种乳酸菌均能在改善酵母抽提物实验中做进一步研究，且发酵周期确定为24 h。

2.2 不同发酵体系下酵母抽提物风味分析

图2 酵母抽提物在不同发酵体系下风味物质热图分布Fig. 2 Heat map of flavor substances in yeast extract in different fermentation systems

如图2所示，FG10型号酵母抽提物通过气相检测表明包含的酵母味主体物质有丙酸和异戊酸。与发酵前相比，在乳酸乳球菌和乳酸链球菌混合发酵（R+L）、乳酸乳球菌和植物乳杆菌混合发酵（R+Z）和三菌混合发酵（R+L+Z）体系下，发酵结束后酵母抽提物的风味物质总含量略微降低，下降2 ng/mL左右。剩余4种发酵体系下酵母抽提物发酵终点的风味物质总含量均上升，其中乳酸链球菌单菌发酵后风味物质总含量增加最高，增加了387.63 ng/mL。乳酸链球菌和植物乳杆菌混合（L+Z）发酵后，风味物质总含量增加量也较高，增加了148.12 ng/mL。酵母抽提物中具有腐败臭味的丙酸在7种发酵体系下均被明显消除，L+Z体系下，发酵6 h后丙酸才完全去除。在3种乳酸菌单菌、2种两菌混合（R+Z、L+Z）和R+L+Z发酵后，酵母抽提物中具有酸臭味的异戊酸均有增加，2种两菌混合（R+Z、L+Z）和R+L+Z发酵后增加量最多，分别增加了19.79、22.58 ng/mL和22.32 ng/mL。只有两菌混合发酵（R+L）体系能大幅减少酵母抽提物中异戊酸的含量，与发酵前相比降低了86.73%。

除两菌混合（R+Z）和R+L+Z发酵外，酵母抽提物中具有花香、果香的醇类物质2,3-丁二醇、异戊醇和苯乙醇均有部分或全部增加。其中，乳酸链球菌发酵后醇类物质增加最明显，达253.63 ng/mL，占总风味物质的61.09%；而L+Z发酵后，醇类物质中仅单一的异戊醇增加明显，增加了82.54 ng/mL。酵母抽提物中特征香味吡嗪类物质在植物乳杆菌单菌、2种两菌（R+Z、L+Z）和R+L+Z发酵下被完全消耗，而在另外3种发酵体系下均有略微增加，表明植物乳杆菌在单菌和混菌体系下均有利用吡嗪类物质的能力。除了R+L+Z体系外，剩余6种发酵体系均能产生具有奶香味的乙偶姻。乳酸链球菌发酵后乙偶姻增加量最多，达142.20 ng/mL，L+Z发酵后乙偶姻生成量也较高，为57.49 ng/mL。3种两菌发酵（R+L、R+Z、L+Z）体系下，酵母抽提物中具有杏仁香气的苯甲醛被消耗完全。

随后对酵母抽提物挥发性风味物质进行PCA，结果如图3所示，由此产生的PCA前2个PC占总方差的77.48%，其中PC1占47.97%。7种发酵体系下酵母抽提物中的风味物质均处于不同象限和不同位置，说明7种发酵体系下酵母抽提物中挥发性风味物质具有明显差异。

图3 酵母抽提物在不同发酵体系下风味PCAFig. 3 PCA plot of flavor components of yeast extract in different fermentation systems

乳酸链球菌单菌发酵后，醇类物质和乙偶姻增加明显，且乳酸链球菌和植物乳杆菌混菌发酵后，异戊醇和乙偶姻也增加明显。植物乳杆菌在单菌和混菌条件下均有消耗利用吡嗪类风味物质，可能导致酵母抽提物中典型风味物质被消耗。可见，两菌混合（R+L）发酵后，整体风味物质含量降低，刺激性酵母味（丙酸、异戊酸）明显去除。同时具有花香、果香和奶油香等风味化合物均有提高，其中具有果香和花香的醇类物质从0.77 ng/mL增加至10.73 ng/mL，使得酵母抽提物的整体风味呈现效果较好。值得注意的是，以上风味化合物（除丙酸和异戊酸外）均与酱香典型体基酒风味的重要骨架成分一致[26-27]。

2.3 不同发酵体系下酵母抽提物感官评定

对在7种发酵体系下发酵24 h的酵母抽提物进行了感官评定，结果如图4所示。

图4 酵母抽提物在不同发酵体系下发酵24 h的感官评定Fig. 4 Sensory evaluation of yeast extract fermented for 24 h with different cultures

如图4所示，7种发酵体系下，酵母抽提物中的酵母味24 h发酵后均去除，且有新风味产生，但整体的感官评定有差异。其中，酵母抽提物经乳酸乳球菌单菌发酵后产生异味，而经乳酸链球菌或植物乳杆菌单菌发酵后，酵母抽提物中酵母味去除的同时均有弱酸味。两菌发酵体系下，R+L发酵后，酵母抽提物的风味具有明显提升，无酵母味、无异味、产酸且伴随浓郁的发酵酱香味；R+Z发酵后，酵母抽提物的风味略微提升，有微弱的酸味和酱香味；L+Z发酵后，刺激性酸味明显。R+L+Z发酵后，酵母抽提物风味有提升，无酵母味、无异味，且形成较高的发酵酱香味。然而，与两菌发酵（R+L）相比，R+L+Z发酵后，酵母抽提物无酸味产生，无法达到促进酵母抽提物整体风味协调性的效果。综上，7种发酵体系下两菌发酵（R+L）后风味最佳，利于发酵调味品的研制。

基于上述7种发酵体系下酵母抽提物的风味和感官评定可知，酵母抽提物经R+L后，达到去除酵母味目的的同时还有形成酱香风味的效果。因此，对乳酸乳球菌和乳酸链球菌单菌和两菌发酵下的酵母抽提物进行深入分析比较。

2.4 乳酸乳球菌与乳酸链球菌在单菌和混菌发酵体系下酵母抽提物中风味前体氨基酸分析

芳香族氨基酸及支链氨基酸是乳酸菌主要的风味物质形成前体氨基酸[28]，其中苯丙氨酸通过转氨、脱羧和脱氢生成玫瑰香味的苯乙醇，支链氨基酸亮氨酸可通过氨基酸代谢产具有水果香味的异戊醇[15,29]。

图5 酵母抽提物在乳酸乳球菌与乳酸链球菌单菌和混菌体系下风味前体氨基酸的变化Fig. 5 Changes of flavor precursor amino acids in yeast extracts fermented with single and mixed cultures of L. lactis and S. lactis

如图5a所示，乳酸乳球菌与乳酸链球菌单菌和混菌发酵体系下，亮氨酸的变化呈现差异性。乳酸乳球菌单菌发酵6 h后，亮氨酸含量基本保持稳定，相比发酵前降低了202.97 mg/L，而异戊醇未检测到。乳酸链球菌单菌发酵后，亮氨酸呈现先降后增的变化，发酵12 h后亮氨酸含量具有小幅度回升，然而发酵结束后亮氨酸质量浓度仍比发酵前降低了88.48 mg/L，异戊醇生成量最高为179.38 ng/mL。两菌发酵（R+L）后，亮氨酸呈现先降后升再降的波动性变化，发酵6 h的亮氨酸质量浓度最低，降低了251.64 mg/L；发酵12 h亮氨酸质量浓度达到最高为368.05 mg/L，高于发酵前含量；发酵结束后，亮氨酸质量浓度降低至105.09 mg/L，相比于发酵前降低了176.71 mg/L，同时对应的异戊醇生成了2.83 ng/mL。

如图5b所示，3种发酵体系下酵母抽提物中的苯丙氨酸均有增加。乳酸链球菌单菌发酵后，苯丙氨酸在发酵6 h质量浓度最高为139.09 mg/L，6 h后持续降低至68.84 mg/L，而发酵结束时相应苯乙醇的积累量为71.98 ng/mL。剩余2种发酵体系下，苯丙氨酸在整个发酵过程中持续增加。乳酸乳球菌单菌发酵后，苯丙氨酸的生成量最高，为194.75 mg/L，而苯乙醇未生成。R+L发酵后，苯丙氨酸的积累量为142.45 mg/L，对应的苯乙醇有1.31 ng/mL的生成量。

乳酸链球菌单菌发酵后，异戊醇和苯乙醇的生成量最高，而呈苦味的亮氨酸积累最高，呈鲜味的苯丙氨酸积累量较低。两菌发酵后酵母抽提物风味前体氨基酸积累的同时（苯丙氨酸大幅提升），相应的风味化合物也相应增加，结合感官评价结果，乳酸乳球菌和乳酸链球菌混酵使得无酵母味的酵母抽提物中的氨基酸与风味代谢物处于较佳的平衡状态，利于改善酵母抽提物的整体风味。

2.5 乳酸乳球菌与乳酸链球菌单菌和混菌发酵体系下酵母抽提物中呈味物质分析

呈味是评价酵母抽提物作为调味剂的重要指标，因此，选用乳酸、谷氨酸和核苷酸（肌苷酸+鸟苷酸）3个指标对酵母抽提物在乳酸乳球菌与乳酸链球菌单菌和混菌体系下呈味变化进行分析，结果如图6所示。

图6 酵母抽提物在乳酸乳球菌与乳酸链球菌单菌或混菌体系下呈味变化Fig. 6 Taste change of yeast extract fermented with single and mixed cultures of L. lactis and S. lactis

乳酸是乳酸菌主要的有机酸产物之一，具有爽口口感，使发酵调味品的咸味更加柔和[28]。如图6a所示，随着发酵时间的延长，乳酸含量持续增多。不同发酵体系下乳酸生成量不同。其中乳酸链球菌单菌发酵后的乳酸生成量最低，为3.28 g/L。乳酸乳球菌单菌发酵后的生成量为6.30 g/L。与单菌发酵相比，两菌发酵（R+L）后酵母抽提物中的乳酸含量最高，发酵结束后达10.60 g/L，说明混合发酵更利于乳酸的积累，丰富了发酵后酵母抽提物的风味和呈味。

谷氨酸是一类重要的鲜味氨基酸，是鲜味增强剂的重要来源[30-31]。如图6b所示，在乳酸乳球菌和乳酸链球菌单菌或混菌发酵体系下，酵母抽提物中的谷氨酸含量均被部分利用。乳酸乳球菌单菌发酵后谷氨酸降低了52.68%。乳酸链球菌在单菌发酵过程中对谷氨酸的需求低于乳酸乳球菌单菌发酵，在该发酵体系下谷氨酸降低了42.28%。在乳酸乳球菌的基础上，两菌发酵（R+L）后，发酵体系对谷氨酸的需求降低，发酵结束后，谷氨酸的消耗量略微降低，消耗了41.46%。

肌苷酸和鸟苷酸是核苷酸中主要呈鲜味物质，是影响酵母抽提物整体呈味的重要因素之一[32]。2种乳酸菌单菌发酵6 h后，酵母抽提物的核苷酸具有明显差异，乳酸乳球菌单菌发酵后核苷酸含量降低了47.32%；乳酸链球菌单菌发酵后核苷酸质量浓度明显提升，增加了53.01%。乳酸乳球菌与乳酸链球菌混酵体系中，发酵前6 h内核苷酸基本没变，而发酵6 h后与乳酸乳球菌单菌发酵呈相同的变化趋势，均为先升后降的波动性变化。与发酵前相比，乳酸链球菌单菌发酵结束后，核苷酸降低了0.02 g/L；乳酸乳球菌单菌发酵结束后核苷酸含量不变；R+L发酵后，核苷酸质量浓度增加了0.02 g/L（图6c）。

3种发酵体系下，乳酸、谷氨酸和核苷酸（肌苷酸+鸟苷酸）的变化具有差别，R+L发酵后乳酸产量最高；谷氨酸在乳酸乳球菌和乳酸链球菌单菌和混菌发酵体系下均降低，其中乳酸乳球菌单菌发酵后谷氨酸含量降低最明显，降低了52.68%；核苷酸含量呈现波动性变化，其中两菌（R+L）发酵结束后核苷酸含量增加了0.02 g/L。可见，与单菌发酵相比，R+L发酵后，呈味呈现最佳水平状态。

3 结 论

以酵母抽提物为主要营养组分，探索了3种乳酸菌对酵母抽提物酵母味消除和风味改善的效果。结果表明，经过乳酸菌发酵酵母抽提物的风味具有明显变化，具有酵母味的丙酸和异戊酸被去除，具有花香、果香的风味物质提高。可见，乳酸菌是一类有效消除酵母味的微生物。然而，不同发酵体系下风味化合物变化具有差异，导致整体风味不同，如乳酸链球菌增加苯乙醇、异戊醇的能力明显。值得注意的是，单纯增加风味物质可能导致发酵后期整体风味不协调。酵母抽提物经乳酸乳球菌和乳酸链球菌混合发酵后，酵母味明显去除，良好风味含量均有一定提高，乳酸大幅提升，呈味物质核苷酸少量增加，呈鲜味的风味前体氨基酸具有一定提高，导致整体风味和呈味呈现最佳状态。