黎 燕，孙志刚，陈利红，周 红

（1.上海理工大学，上海 200093；2.宁夏启元国药有限公司，银川 750011）

金莲清热颗粒为《中国药典》（2020年版一部）收载品种[1]，由金莲花、大青叶、石膏、知母、地黄、玄参、苦杏仁（炒）七味中药组成，其中金莲花是该产品的君药之一，主要有效成分为黄酮类和生物碱类物质[2-3]。其中牡荆苷为主要的黄酮类物质，是金莲清热颗粒的有效成分之一[4-5]。《中国药典》将牡荆苷含量作为金莲清热颗粒的质控标准，规定1 g金莲清热颗粒中牡荆苷（C21H20O10）含量不得少于0.32 mg[1]。本研究按照《中国药典》标准方法，检测金莲清热颗粒中牡荆苷的含量，并在此基础上，通过体外酶学实验，探索金莲清热颗粒抑制冠状病毒蛋白酶活性效果。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂

主要仪器：酶标仪（型号：SpectraMax M2e，Molecular Devices公司）；LC-15C高效液相色谱仪（岛津公司）；KQ5200B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER TOLEDO ME55电子天平（METTLER TOLEDO公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（上海皓昕机电设备有限公司）。主要试剂：Tris base（Sigma7-9）、EDTA、NaCl、TCEP、BSA等。乙腈、乙酸铵为色谱纯，正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、氯仿均为分析纯。

1.2 实验材料

1.2.1 受试样品和对照化合物1）受试样品金莲清热颗粒：由宁夏启元国药有限公司提供（样品编号：USST-LY-Y2020-1），牡荆苷的含量测定选取3个批次样品（200420-1、200420-2、200420-3）。体外酶学实验样品批号：200420-1。配制方法：受试样品在实验当天使用无菌水溶解到800 mg·mL-1，经100℃水浴加热10 min，冷却至室温后取上清液用于测试。2）对照化合物：3CLpro抑制剂（GC376），来源：TargetMol（批号：T5188-1），贮存条件：-80℃。配制方法：对照化合物用100%二甲基亚砜（DMSO）配制成100 mmol·L-1的母液，分装后冷冻保存于-80℃。

1.2.2 主要蛋白酶（main protease，Mpro） 蛋白Mpro（NC_045512）蛋白酶蛋白（批次号：RP200 225A）由上海药明康德新药开发有限公司克隆表达。冷冻保存在-80℃中。

1.2.3 Mpro底物Mpro底物（KTSAVLQSGFRKM）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。批次号为C398JFC160-1/PE9237。

1.2.4 牡荆苷（Vitexin） 供含量测定用，含量以94.9%计，纯度＞98%。由中国食品药品检定研究院提供。批号：111687-201704。

1.3 牡荆苷含量测定

1.3.1 测定依据及计算公式 依据高效液相色谱法（《中国药典》2020年版四部通则）测定；色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4%乙酸铵溶液（15∶85）；检测波长为340 nm；流速为1.0 mL·min-1。系统适用性条件：理论板数（n）按牡荆苷峰计算应不低于3 000；相对标准偏差应不大于2.0%。计算公式：

其中A样为样品牡荆苷峰的平均峰面积；A标为对照品峰的平均峰面积；W标为对照品的称样量；W样为样品的称样量。

1.3.2 受试样品溶液的制备方法 取适量受试样品置乳钵中研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，用50 mL移液管精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声（功率250 W，频率33 kHz）处理1 h，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用25 mL移液管精密量取续滤液25 mL至蒸发皿内，水浴上蒸干，残渣用20 mL量筒加水20 mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次（30 mL、30 mL、30 mL、20 mL），合并正丁醇液至蒸发皿内，水浴上蒸干，用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.3 牡荆苷对照品溶液的制备 取牡荆苷对照品约10 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用5 mL移液管精密吸取5 mL至50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

1.4 体外酶学实验

本研究应用体外酶学实验探索研究金莲清热颗粒抑制冠状病毒主要蛋白酶蛋白（SARSCoV-2 Mpro）活性，以GC376为对照化合物，监控实验质量。1）先将梯度稀释后的受试样品和对照化合物（10个浓度，三复孔）加入384孔测试板，每孔加入3 μL。HPE孔中含有终浓度为1 μmol·L-1的对照化合物GC376，ZPE孔中加入DMSO液。各化合物测试终浓度见表1。同时检测化合物自身对荧光信号的干扰本底。2）在化合物孔板中的第13～24列加入每孔22 μL的34 nmol·L-1的Mpro蛋白溶液，第1～12列加入22 μL工作浓度的缓冲液。SARS-CoV-2 Mpro蛋白的终浓度为25 nmol·L-1。3）受试样品和对照化合物与酶孵育30 min后，在化合物孔板中每孔加入5 μL浓度为150 μmol·L-1的底物反应体系，总体积为30 μL，底物终浓度为25 μmol·L-1。4）离心后将测试板放入30℃培养箱中孵育60 min后，使用酶标仪检测每孔荧光强度。检测条件为：Ex/Em=340 nm/490 nm。应用如下公式计算化合物抑制率：抑制率（%）=［（CPD-BGCPD）-（ZPEBGZEP）/（HPE-BGHPE）-（ZPE-BGZPE）］×100%，其中CPD为化合物孔的信号值；HPE（hundred percent effect）：100%有效作用对照孔信号平均值，孔中含有1 μmol·L-1的GC376，Mpro蛋白和底物；ZPE（zero percent effect）：无效作用对照孔信号平均值，孔中含有Mpro蛋白和底物。BG（back ground）：化合物自身荧光值。

表1 样品测试浓度

1.5 统计学方法

使用GraphPad Prism（version 6）软件对化合物的抑制率（%）数据进行非线性拟合分析，得到化合物的IC50值（50% inhibitory concentration，即半数抑制浓度）。曲线拟合方法为log（inhibition）vs.response-Variable slope。

2 结果

2.1 金莲清热颗粒中牡荆苷含量

三批金莲清热颗粒的牡荆苷含量测定结果见表2、图1~图6；根据本产品的处方折算，三批产品金莲花中牡荆苷平均转移率为63.55%，平均含量值为0.42 mg·g-1。

图1 牡荆苷对照品HPLC图谱（200420-1）

图6 金莲清热颗粒HPLC图谱（200420-3）

表2 金莲清热颗粒中牡荆苷含量

图2 金莲清热颗粒HPLC图谱（200420-1）

图3 牡荆苷对照品HPLC图谱（200420-2）

图4 金莲清热颗粒HPLC图谱（200420-2）

图5 牡荆苷对照品HPLC图谱（200420-3）

2.2 金莲清热颗粒抑制SARS-CoV-2 Mpro活性

受试样品金莲清热颗粒和对照化合物GC376对SARS-CoV-2 Mpro活性测试的抑制率见表3、表4。金莲清热颗粒在5～80 mg·mL-1浓度范围内，抑制率平均值分别为86.63%、94.20%、99.83%、100.87%、101.63%；对照化合物GC376在0.123～10 μmol·L-1浓度范围内，抑制率平均值分别为60.40%、97.67%、96.40%、102.57%、102.93%。根据抑制率数据进行非线性拟合分析。结果显示对照化合物GC376对SARS-CoV-2 Mpro的IC50值为0.040 μmol·L-1，且剂量效应曲线拟合良好。受试样品金莲清热颗粒对SARS-CoV-2 Mpro活性抑制的IC50值为1.977 mg·mL-1。用log（inhibition）vs.response-Variable slope方法进行曲线拟合，见图7。

图7 金莲清热颗粒和对照化合物对SARS-CoV-2 Mpro的抑制活性剂量效应拟合曲线

表3 金莲清热颗粒对SARS-CoV-2 Mpro活性的抑制率（%）

表4 对照化合物对SARS-CoV-2 Mpro活性抑制率（%）

3 讨论

金莲清热颗粒有解热镇痛、调节免疫、止咳平喘、抑制细菌、抑制病毒、抑制炎症等作用。目前，金莲清热颗粒已被用于甲型流感、呼吸道合胞病毒等所致的病毒性肺炎的临床治疗。

牡荆苷是金莲花中主要的黄酮类物质，具有清热消炎等作用，其含量是否达到《中国药典》规定的标准是评价金莲清热颗粒质量的主要指标[6-7]。本研究按照《中国药典》标准方法测定金莲清热颗粒中牡荆苷的含量，结果显示：三批产品金莲花中牡荆苷平均转移率为63.55%，平均含量值为0.42 mg·g-1。据此可见金莲清热颗粒中牡荆苷含量达到《中国药典》的质量要求。Mpro是冠状病毒的一种非结构蛋白，在病毒复制酶复合体成熟过程中发挥了关键作用，是冠状病毒感染防治药物研发的潜在靶点。GC376是一种广谱性3C类蛋白酶抑制剂，能抑制多种病毒复制。有研究[8-11]显示，GC376与瑞德西韦组合使用，可产生累加的病毒抑制作用，结构分析表明，两种抑制剂与SARS-CoV-2蛋白酶Mpro的催化活性侧结合是抑制的主要机制。本研究应用体外酶学实验，以化合物GC376体外抑制SARS-CoV-2 Mpro活性的抑制率作为参照对象，根据抑制率数据，用log（inhibition）vs.response--Variable slope方法进行曲线拟合，结果显示金莲清热颗粒抑制SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶活性的IC50值为1.977 mg·mL-1。

综上所述，金莲清热颗粒中牡荆苷含量达到《中国药典》的质量要求，对冠状病毒SARS-CoV-2 Mpro活性有一定的抑制作用，为更深入研究金莲清热颗粒的抑制冠状病毒活性的有效成分与结构特征等提供了线索。