蒯文和，马江涛，刘 翔，马学平，曹 慜，张银豪，赵建华

（宁夏疾病预防控制中心，银川 750004）

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）SARS-CoV-2引起的急性传染病[1]，已形成全球大流行，每日都有新增和死亡病例的报道[2]，严重危害人类健康。随着国内新冠肺炎疫情的有效控制和境外输入病例的不断发现，加强输入病例防控成为我国现阶段防控的主要任务。本文通过对2020年2月25日宁夏发现的中国首例境外输入病例开展回顾性全基因组分析，旨在从分子水平解释该病例标本的病毒基因特点和变异情况，为后续国内输入性病例研究提供资料。

1 资料与方法

1.1 病历资料

丁某某，男性，23岁，未婚，户籍地为中卫市中宁县大战场乡清河村，入境前在伊朗从事翻译工作。2020年2月19日乘坐飞机从伊朗出发，2月20日中转莫斯科后抵达上海浦东机场，2月22日乘火车次日到达兰州，2月24日乘火车到达中卫后，医学隔离观察期间，咽拭子检测为新冠病毒核酸阳性。

1.2 SARS-CoV-2核酸检测

病例鼻咽拭子标本使用Qiagen公司病毒核酸RNA提取试剂盒（滤柱法），按照试剂盒说明书提取病毒RNA，提取物使用上海伯杰公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）进行检测。

1.3 文库制备及高通量测序

利用Invitrogen公司的Invitrogen SuperScriptTMⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix试剂盒使用随机引物（Random Hexamers，试剂盒自带）进行反转录，合成第一链，使用PCR仪和冰浴进行逆转录。反应体系为：RNA 6 μL，Random hexamers primer 1 μL，Annealing Buffer 1 μL；65℃5min，冰上2min后；再加入2×First-Strand Reaction Mix 10 μL，SuperScriptⅢEnzyme Mix 2 μL；25℃10 min，50℃50 min，85℃5 min。第一链cDNA合成后使用Qiagen Multiplex PCR kit按照说明书进行第二链cDNA扩增，4℃保存。双链cDNA用Qubit 2.0荧光计准确定量后，使用TruePrep DNA library prep kit V2 for ILlumina构建文库。然后在ILluminaMiseq测序仪上进行下一代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS）测序。

1.4 病毒全基因组获取

NGS测序数据使用生物学软件CLC Genomics Workbench 12.0软件去除接头和低质量序列后，以SARS-CoV-2Wuhan-Hu-1（MN908947.3）[3]全基因组序列为参考序列，提取有用的reads，使用mapping获取consensus序列后进行单核苷酸变异（SNP）检测，对存在SNP位点和拼接质量差的序列区段，设计引物扩增后使用sanger测序法进行验证，获取完整SARS-CoV-2全基因组序列。

1.5 生物信息学分析

在NCBIGenBank数据库和国家生物信息中心（CNCB）中下载不同国家和地区SARS-CoV-2基因组序列77条，以及宁夏本地确诊病例序列12条和丁某某序列1条，合计90条全基因组序列。使用生物学软件MEGA7构建系统发育树，采用最大似然法，选择Kimura2-parameter模型，构建系统发生树，用bootstrap重复抽样1 000次对进化树进行验证。

2 结果

2.1 流行病学调查

丁某某2019年9月10日以来居住伊朗库姆市穆斯塔法大学宿舍，其上学期间通过网络群聊兼职翻译工作，经常与其他中国籍同学在未做防护的情况下外出买菜。与丁某某一起的中国籍同学马某，回国后于2020年2月29日在北京确诊；2月18日，丁某某归国前与他人聚餐，聚餐人员中有后期确诊和疑似病例。2月19日，丁某某从伊朗中转莫斯科入境，20日抵达浦东机场，此后一直佩戴N95口罩，并尽量减少与他人接触，2月24日到达中卫。

2.2 实时荧光RT-PCR检测结果

经实时荧光RT-PCR检测，丁某某咽拭子标本SARS-CoV-2RNA结果为阳性。ORF1ab、N和E基因Ct值分别为27.7、26.3和27.5，阳性对照、阴性对照和内部质控结果均成立。

2.3 基因组测序基本数据

测序下机Rawreads数量为17.38 G，使用fastqc软件对原始数据进行质控并过滤后，获得cleanreads数量为86.0 M，Q30以上数据94.74%，GC含量50.65%，得到100%完整覆盖率的基因组序列。组装成功的全基因组序列命名为SARS-CoV-2/human/Ningxia/DSQ/2020/Asia/China（以下简称DSQ/2020），通过基因组序列比对获得29 903 bp的基因组序列，开放读码框（ORF）从5’UTR起始密码子（TAG）到3’UTR终止码子（TAG），包含11个基因（266～29 674），包括4个结构蛋白基因（S、E、M、N）和7个非结构性蛋白（ORF1ab、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF10）[3]，见表1。获得的DSQ/2020全基因组序列与CNCB公布武汉第一株病毒株NC_0455122.2的组成和结构一致，没有碱基的缺失和插入，未发现结构性变异，但存在变异现象，见表1。

表1 DSQ/2020和参考序列编码框核苷酸和氨基酸同源性分析

2.4 同源性分析

与参考株NC_0455122.2相比，DSQ/2020仅在ORF1ab区域发现了3个SNP，分别为G11083T、T11244C和T11318C，产生了3个错义突变，分别为L-＞F（亮氨酸-＞苯丙氨酸）、V-＞A（缬氨酸-＞丙氨酸）、Y-＞H（酪氨酸-＞组氨酸），其余区域均未发现变异；与宁夏其他12株SARS-CoV-2相比，不同序列之间存在3～25个SNP，核苷酸多态性主要发生在ORF1ab区域，该区域发现19个SNP，S区域发现3个，ORF7区域发现2个，E区域发现1个；通过与其他国内参考序列和12株宁夏株相比，丁某某作为伊朗回国病例，DSQ/2020具有3个与国内株均不一致的SNP位点（G11083T、T11244C和T11318C）。除了在ORF1ab区域发现了3个SNP位点之外，DSQ/2020在8287位点为C，28144位点为T，按照目前SARSCoV-2不同分型方法，该毒株属于L-Lineage/LineageB谱系SARS-CoV-2。

2.5 基因进化及溯源分析

2.5.1 病毒谱系划分 对国内外不同地区来源的新冠病毒全基因组序列进行进化分析，进化关系显示，全球流行SARS-CoV-2可以划分为2个分 支，S-Lineage/LineageA和L-Lineage/LineageB[4]。以全基因组序列进行进化分析，如图1所示，DSQ/2020与欧洲L谱系的流行株同处于L-Lineage/LineageB分支，属于L-Lineage/LineageB谱系SARS-CoV-2，这与SNP分型法划分的谱系一致，见图1。

2.5.2 溯源分析 按照流行时间来看，DSQ/2020与2019年12月武汉的流行株、2020年2月北京流行株[5]以及2020年2月宁夏流行株，均存在较大差别，处于不同进化分支，属于不同谱系的病毒，证实DSQ/2020为境外输入病例。

2.5.3 基因进化分析 全基因组进化树显示，DSQ/2020与土耳其、巴基斯坦和缅甸等来源的毒株位列同一分支，这与我国北京新发地疫情（2020年6月）[6]、河北石家庄疫情（2021年1月）[7]、广州2例输入病例（2021年3月）[8]等后期病例均有不同，处于不同的进化分支，DSQ/2020处于LineageB.2进化分支，而后期北京、石家庄和广州等地确诊病例处于LineageB.1进化支[6，8]。而且核苷酸和氨基酸变化均不一致，进一步证实DSQ/2020属于伊朗输入病例，见图1。

图1 基于最大似然法构建的SARS-CoV-2全基因组序列进化树

3 讨论

SARS-CoV-2为RNA病毒，容易发生变异，加之流行范围广，导致病毒谱系呈现多样化分布。通过8 782位和28 144位核苷酸变异的分型鉴定，在2020年1月7日之前流行主要为S/A型，而2020年1月7日后主要为L/B型[4，9]；同时国内不断有新的基因型别病毒输入，如2020年6月北京新发地[6]疫情被证实为B1亚型，2021年1月河北石家庄[7]疫情被证实为B.1.1.123型，2021年3月广州[8]疫情被证实为B.1.525型。随着国外疫情的进一步发展，“外防输入”对我国疫情防控来说显得尤为重要，因此加强对不同时期、不同地区输入病例标本的全基因组变异监测具有重要意义[10-11]。

2020年2月25日之前，我国未见有境外输入病例的报道，经与中国疾控中心沟通，此病例为中国首例境外输入性病例。本文针对我区发现的我国首例境外（伊朗）输入性病例标本（DSQ/2020）开展回顾性调查和病毒全基因组变异分析，旨在与近期我国几起输入性病例进行比较和病原学溯源分析。SNP分析发现，DSQ/2020株与宁夏株和国内其他省份流行株相比，核苷酸变异主要发生在ORF1ab区域，且该突变与国内株变异位点均不一致（G11083T、T11244C和T11318C），在初步证实丁某某为国外输入病例的基础上，提示要加强对输入病例的全基因组变异监测，及时掌握病毒变异情况，科学分析国外输入SARS-CoV-2对我国现行注射疫苗的有效性。病毒进化分析发现，DSQ/2020株与同一时期宁夏和其他地区流行株均不在同一谱系，而与巴基斯坦、土耳其等国家流行株处于同一进化分支，病毒遗传距离较近，再结合巴基斯坦、土耳其等国家为伊朗周边国家，而2020年2月，伊朗、巴基斯坦和土耳其等国家疫情较为严重，根据丁某某旅居史，证实了该病例为伊朗输入病例。

丁某某病例经证实为我国首例境外输入性新冠肺炎病例，从此拉开了我国新冠肺炎防控“外防输入”的序幕。通过与我国近期发生的几起输入性疫情的病毒特性比较来看[6，8]，DSQ/2020是宁夏首例输入性病例，并从其发现时间证实也是我国的首例输入性病例。相对于我国近期境外输入的新冠病毒全部处于LineageB.1进化支[6，10]，DSQ/2020与宁夏本地流行株和国内其他地区流行株均不处于同一个进化支，遗传距离较远，pangolin分型显示基因型别为B型，与B.4和B.6型病毒亲缘关系较近。本研究所选的SARS-CoV-2为疫情早期毒株，SNP位点的多元性和基因型别的多样性，表明该病毒短时期内在全球暴发流行，而且容易随着传播及流行发生基因变异。随着疫情的发展，变异后的病毒是否会发生传染性的改变、致病性的改变或者对疫苗有效性的改变，需要持续监测。

新冠肺炎疫情防控是一个长期的过程，尤其现阶段国内疫情得到有效控制，而国外疫情呈现暴发与流行高发的态势下，加强“外防输入”尤为重要。在发现输入性病例时，及时开展病毒全基因组测序，科学、有效地进行病毒溯源，可为疫情防控提供准确的理论依据。