欧士钰，杜 凌，韦 捷，陈 刚

柳州市工人医院消化内科，广西柳州 545007

肝纤维化是各种慢性肝病进一步向肝硬化发展的必经阶段，是肝脏细胞外基质(ECM)合成与降解平衡紊乱，导致ECM过度沉积的病理过程[1]。目前研究认为，肝纤维化乃至早期肝硬化是可以逆转的[2-3]。荔枝核总黄酮(TFL)是从荔枝核中提取的有效药理成分，研究表明TFL具有抗肝纤维化作用，其机制与TFL可抑制核因子κB p65(NF-κB p65)蛋白表达有关[4]。酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路的激活与促肝纤维化作用密切相关[5-6]。目前，TFL对JAK2/STAT3信号通路是否有干预作用尚鲜见报道，TFL是否通过该信号通路发挥抗肝纤维作用尚未明确。本研究旨在观察TFL对JAK2/STAT3信号通路的影响，进一步探讨TFL抗肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠30只，雄性，SPF级，体重(200±20)g，由中山大学实验动物中心提供(合格证号：SCXK粤2021-0029)。

1.2仪器与试剂 仪器：酶标仪及凝胶成像系统(美国赛默飞世尔科技公司)；电泳仪、电泳槽(美国Bio-Rad公司)；光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。试剂：TFL(南京泽朗医药科技有限公司，纯度80%)；二甲基亚硝胺(DMN，美国Sigma-Aldrich公司)；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、羟脯氨酸(HYP)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制、磷酸酶抑制剂(碧云天生物科技有限公司)；磷酸化JAK2(p-JAK2)抗体、JAK2抗体、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗体、STAT3抗体(CST公司)；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、胶原-Ⅰ(Collagen-Ⅰ)抗体(Proteintech公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1模型制备及给药 采用随机数字表法将30只大鼠分为空白对照组、模型组、TFL组，各10只。模型组、TFL组大鼠按Ala-Kokko方法[7]腹腔注射DMN(0.5%，2 mL/kg)建立肝纤维化模型，共4周，空白对照组不造模。造模同时，TFL组大鼠分别灌胃相应受试药物(TFL，200 mg/kg)，空白对照组及模型组灌服等体积生理盐水，共6周，每天1次。6周后处死大鼠，取血标本和肝组织标本备用。

1.3.2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ALT、AST、HYP水平 将收集到的血标本静置后，3 000 r/min 离心5 min，取血清；取50 mg肝组织标本，匀浆后3 000 r/min 离心15 min，取上清。按照试剂盒说明书检测血清AST、ALT水平和肝组织HYP水平。

1.3.3肝组织病理学检查 常规10%甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后制备切片，经HE染色、Masson染色后，于光镜下观察病理改变。

1.3.4Western blot检测p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、α-SMA、Collagen-Ⅰ 蛋白的表达 取适量肝组织剪碎后冰上裂解，低温离心后取上清获得组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，上样、电泳、转膜、封闭、洗膜，加入相应的稀释的抗体，4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1 h。增强型化学发光(ECL)显影，凝胶成像系统曝光，Image-J软件分析目的蛋白的相对表达量。以GAPDH为内参，至少进行3次独立重复实验。

2 结 果

2.1TFL对肝纤维化大鼠AST、ALT、HYP水平的影响 与空白对照组比较，模型组AST、ALT、HYP水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，TFL组 ALT、AST、HYP水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组AST、ALT及HYP水平比较

2.2TFL对肝纤维化大鼠肝组织病理学改变的影响 空白对照组大鼠肝脏组织肝细胞索排列整齐，肝细胞形态正常，无水肿，无脂肪变性，小叶结构正常，未见纤维间隔，汇管区未见胶原沉积。与空白对照组比较，模型组肝细胞索排列紊乱，肝细胞水肿，脂肪变性，多数正常小叶结构破坏或消失，形成假小叶。与模型组相比，TFL组肝细胞坏死明显减少，假小叶消失。见图1、2。

2.3各组肝纤维化大鼠肝组织JAK2/STAT3信号通路的变化 Western blot检测结果显示，模型组肝组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的表达较空白对照组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，TFL组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的表达不同程度降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝组织JAK2/STAT3信号通路的表达情况

2.4各组肝纤维化大鼠肝组织α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白表达 Western blot检测结果显示，肝纤维化模型组肝组织α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白的表达较空白对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，TFL组α-SMA、Collagen-Ⅰ的表达不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

注：A为空白对照组；B为模型组；C为TFL组。

注：A为空白对照组；B为模型组；C为TFL组。

表3 各组大鼠肝组织α-SMA、Collagen-Ⅰ表达的变化

3 讨 论

肝纤维化是各种原因的慢性肝病向肝硬化发生、发展过程中的一个重要阶段，多种病因如炎症、乙醇、化学毒物、寄生虫、乙型肝炎病毒、胆汁淤积及胆道梗阻等，均可以使肝脏发生纤维化，如果这些因素持续存在，可使肝纤维化发展至肝硬化，甚至肝癌[1]。但是，如果在肝纤维化早期阶段去除或抑制这些病因，肝纤维是可以缓解甚至逆转的[2]。中医药在抗肝纤维化领域具有很大优势，TFL具有抗肝纤维化及保肝作用，但其具体机制尚不完全清楚。

本研究建立大鼠肝纤维化动物模型，进一步研究TFL抗肝纤维化作用及其机制。DMN是一种化学毒物，具有肝毒性，可以在肝细胞线粒体中代谢为乙醛，进而与蛋白质交联；也可代谢产生活性甲基化基因，引起核酸、蛋白质的甲基化，使肝细胞坏死凋亡，DMN还可通过氧化应激使肝脏脂质过氧化，刺激肝星状细胞(HSC)活化，使细胞外基质胶原蛋白产物增多或降解减少，胶原过度沉积，导致肝纤维化发生、发展。DMN诱导的肝纤维化动物模型胶原沉积与人类肝硬化早期改变的病理特点非常相似，是目前进行肝纤维研究的常用动物模型[7-8]。

本研究中肝模型组肝组织病理切片提示肝索排列紊乱，有较多的成纤维细胞出现，纤维结缔组织增生，纤维间隔形成，提示大鼠肝纤维化模型复制是成功的。本研究结果显示，与模型组比较，TFL治疗干预6周后，TFL组大鼠血清ALT、AST、HYP及α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白表达均降低(P<0.05)，且病理结果提示，TFL能改善肝组织损伤及纤维化程度，提示TFL有较好的治疗肝纤维化及保肝作用，与相关报道一致[9]。

有研究认为，JAK2/STAT3信号通路与肝纤维化密切相关，HSC的活化是肝纤维进程关键的关键因素[2，5-6]，HSC膜上特异性受体亚单位与血小板源生长因子、瘦素、转化生长因子β等促肝纤维化细胞因子发生同源或异源寡聚化后，从而使与受体偶联的JAKs被激活，继而使受体细胞质段的酪氨酸磷酸化为含SH2的蛋白停泊位点，下游信号蛋白分子被激活使靶基因发挥作用，STAT蛋白末端的酪氨酸残基(Tyr705)、丝氨酸残基(Ser727)同时可被JAKs诱导而发生磷酸化，进而激活STATs蛋白，形成同源或异源STATs蛋白二聚体进入细胞核结合相应靶基因的启动子，从而使靶基因转录活化HSC，参与肝纤维化发生、发展[5，10-11]。本研究结果显示，肝纤维化模型组肝组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白较空白对照组明显升高，提示DMN所诱导大鼠肝纤维化过程中大鼠肝组织JAK2/STAT3 信号通路活化，参与了肝纤维化的发生、发展过程；TFL组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3较空白对照组降低，提示TFL可抑制JAK2/STAT3信号通路。因此，笔者认为JAK2/STAT3至少部分参与了肝纤维化的形成，TFL可能通过抑制转录因子JAK2/STAT3而发挥抗肝纤维化作用。

TFL对DMN诱导的肝纤维化具有较好的治疗作用，有可能逆转肝纤维化,其机制可能与抑制JAK2/STAT3蛋白的表达，阻断JAK2/STAT3信号通路的信号传导有关，但肝纤维化的形成机制极其复杂，TFL抗肝纤维化的作用机制仍需进一步深入研究。