周 岳，韩 博

1.西安大兴医院普通外科，陕西西安 710000；2.西安国际医学中心医院消化外科，陕西西安 710100

结肠癌是一种较为常见的消化道恶性肿瘤，多发生于直肠与结肠的交界处。以40～50岁年龄段发病率最高，占所有恶性肿瘤的10%～15%[1]。近年结肠癌发病率逐年上升，其早期症状不明显，多数患者确诊时常已是中晚期，预后不佳[2]。基于分子生物学的研究为临床肿瘤发病机制探究提供了方向，也为临床提供了新的肿瘤治疗靶点。近来研究发现，p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在多种肿瘤如宫颈癌、卵巢癌、肺癌细胞的发生、凋亡、转移过程中发挥重要作用[3-5]。p38 MAPK作为结肠癌研究的一个靶点，在早期诊治、临床分期及预后等方面至关重要。本研究通过免疫组化法检测p38蛋白在人结肠癌组织及癌旁组织中的表达情况，探讨p38蛋白的表达与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性收集2015年6月至2017年6月在西安大兴医院接受手术治疗的110例结肠癌患者肿瘤组织及癌旁组织(距病灶边缘1.5～2.0 cm)石蜡标本，组织标本均经病理学检查明确诊断，患者术前均未行任何相关治疗，临床资料和随访资料完整，患者既往均无恶性肿瘤病史，未合并其他恶性肿瘤。

1.2方法

1.2.1资料收集及随访 收集入组患者临床病理资料包括年龄、性别、肿瘤最大径、病理TNM分期、浸润程度、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况等。术后对所有患者进行随访，截至2020年9月，以死亡作为观察终点，观察患者肿瘤复发、生存情况。

1.2.2试剂 兔抗人p38单克隆抗体购自美国Abcam公司；BCA蛋白检测试剂盒、蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂购自上海碧云天生物技术有限公司；免疫组化试剂盒、DAB显色剂购自赛默飞世尔科技公司。

1.2.3免疫组织化学法检测p38蛋白表达 将组织石蜡标本以4 mm厚度连续切片，烤片20 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，将切片放入枸橼酸缓冲液高压抗原修复，自然冷却至室温，清除抗原修复液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，5%牛血清清蛋白(BSA)室温封闭30 min，滴加p38一抗(1∶50)，4 ℃冰箱孵育过夜；次日取出切片，PBS洗涤3次，滴加山羊抗IgG二抗，室温孵育30 min，PBS洗涤3次，加入DAB溶液显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树脂封片，镜下观察拍照。

1.3结果判读标准 p38阳性染色主要定位在细胞质中。每张切片随机取10个视野，通过染色强度和阳性细胞百分比计算评分。着色强度无着色、黄色、棕黄色、棕褐色依次记为0、1、2、3分，阳性细胞百分比≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%依次记为0、1、2、3、4分。两项评分乘积为总分，总分<3分为阴性，≥3分为阳性。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析。计数数据采用例数、率表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier生存曲线分析p38蛋白表达与结肠癌预后的关系，并行Log-rank检验；采用Cox比例风险模型分析患者生存影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1结肠癌组织中p38蛋白表达情况 免疫组织化学法检测结果显示，p38蛋白主要定位于肿瘤细胞的胞质中，呈棕黄色或棕褐色，见图1。110例结肠癌组织中，p38蛋白阳性表达率为80.9%(89/110)，对应癌旁组织中阳性表达率为7.3%(8/110)，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A为p38蛋白在结肠癌组织中的表达情况；B为p38蛋白在癌旁正常组织中的情况表达。

2.2p38蛋白表达与结肠癌患者临床病理特征的关系 根据免疫组化结果将入组患者分为p38蛋白阳性表达组(89例)和阴性表达组(21例)，单因素分析结果显示，p38蛋白表达与肿瘤浸润程度、TNM分期、分化程度和淋巴结转移情况有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤最大径无关(P>0.05)，见表1。

表1 p38蛋白表达与临床病理特征的关系

2.3p38蛋白表达与结肠癌患者预后的关系 随访至2020年9月，110例结肠癌患者中失访5例，所有入组患者的3年总生存率为60.0%(66/110)，3年无复发生存率为49.1%(54/110)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，p38蛋白阳性表达组总生存率、无复发生存率低于阴性表达组，差异有统计学意义(Log-rankχ2=4.094、4.428，P=0.043、0.035)。见图2。

注：A为结肠癌术后3年总生存情况；B为结肠癌术后3年无复发生存情况。

2.4结肠癌患者预后影响因素的单因素分析 单因素分析显示，肿瘤浸润程度侵及浆膜、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中/低分化程度、有淋巴结转移及p38蛋白表达阳性是结肠癌患者死亡的危险因素(P<0.05)；肿瘤最大径和上述因素亦是结肠癌患者复发的危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 结肠癌患者预后影响因素的单因素分析

续表2 结肠癌患者预后影响因素的单因素分析

2.5结肠癌患者预后影响因素的多因素Cox比例风险模型分析 纳入表2中差异有统计学意义的变量行多因素Cox比例风险模型分析，结果显示，肿瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中/低分化程度、有淋巴结转移、p38蛋白阳性表达是结肠癌患者死亡的独立危险因素(P<0.05)，见表3。而肿瘤最大径>5 cm、浸润程度为侵及浆膜、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中/低分化程度、有淋巴结转移及p38蛋白阳性表达是结肠癌患者复发的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表3 结肠癌患者死亡影响因素的多因素Cox比例风险模型分析

表4 结肠癌患者复发影响因素的多因素Cox比例风险模型分析

3 讨 论

临床结肠癌治疗仍以外科手术为主。研究发现，早期结肠癌5年生存率可达90%以上，而进展期5年生存率不到5%[6]。因此，探究与结肠癌相关的早期诊断标志物及预后影响因素，对提高患者预后具有重要意义。p38是MAPK信号途径的重要组成部分，研究证实激活的p38 MAPK可以调节细胞中的多种生物学反应[7-9]。且近年研究表明，结肠癌中p38 mRNA高表达可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，敲低p38表达后结肠癌细胞的恶性程度降低[10]。因此，基于临床病理探究p38在结肠癌中的表达及与临床病理特征和预后的关系，对结肠癌的早期诊断、治疗及预后评估具有重要作用。

本研究发现，结肠癌组织中p38蛋白阳性高表达，提示p38过表达在结直肠癌中扮演重要角色。同时发现，p38蛋白表达与肿瘤浸润程度、TNM分期、分化程度及淋巴结转移等临床病理特征相关。淋巴结转移是肿瘤获得转移潜能，引起疾病进展的关键，也是肿瘤患者预后不良的危险因素[11]。肿瘤分化程度越低预示着临床分期越高，肿瘤转移、浸润及术后复发风险也升高[11]。相关研究表明，乳腺癌组织中p38蛋白高表达与临床分期、淋巴结转移有关[12]；p38参与调控食管癌细胞的生物学行为进程，与肿瘤最大径、淋巴结转移、分化程度及浸润深度等病理特征关系密切，是判断食管癌发生、发展及浸润转移的有效标志物[13]。p38蛋白高表达预示着肿瘤浸润程度加深、临床分期更晚、分化程度更低及淋巴结转移风险增加。由此表明，p38高表达与肿瘤恶性病理特征相关，促进了结肠癌的发生、发展、浸润及转移。本研究进一步分析p38蛋白表达与结肠癌预后的关系发现，p38阳性表达患者具有更低的3年总生存率与无复发生存率，且p38是结肠癌患者预后不良的独立危险因素，其阳性表达患者发生死亡、复发的风险是阴性患者的1.494、1.651倍，提示可将p38蛋白作为评估结肠癌恶性进展及预后不良的潜在预测指标。

综上所述，结肠癌组织中p38蛋白阳性高表达，与肿瘤浸润程度、TNM分期、分化程度及淋巴结转移等临床病理特征及患者预后有关，可将其作为评估结肠癌患者预后的标志物。p38信号转导通路在结肠癌发生发展中的作用机制还需进一步研究。