梁明明，冯冰

视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞损伤与多种视网膜病变相关疾病的发生发展有关，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是其中之一，也是老年人致盲的重要原因[1]。氧化应激可引起RPE 细胞损伤，抗氧化应激为DR 的治疗策略提供了新思路[2-3]。研究[4]发现，许多微小核糖核酸（microRNA，miRNA）表达水平的变化可能与DR 的发生进展有关。例如，微小核糖核酸-326（microRNA-326，miR-326）在小鼠视网膜中表达上调，影响了视网膜神经发育[5]。还有研究[6]报道，在脂多糖刺激的小鼠肺和巨噬细胞中的miR-326 表达下调，而miR-326 过表达可以通过下调Toll 样受体抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症和氧化应激，减轻急性肺损伤；miR-326/程序性细胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）/核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路改善脂多糖诱导的MRC-5 细胞损伤[7]。然而miR-326能否对RPE 细胞损伤产生影响尚未见报道。生物学软件预测发现miR-326 与环状RNA 泛素特异性肽酶36（circular RNA ubiquitin-specific peptidase 36，circ-USP36）有结合位点。环状RNA 具有环状共价闭合结构，可参与疾病发展，如氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）暴露诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中circ-USP36 上调，降低circ-USP36 可减轻ox-LDL 诱导的HUVEC 损伤[8]。然而circ-USP36 对RPE 细胞损伤的影响及机制也尚未清楚。本研究使用高糖诱导RPE 细胞损伤，探索circ-USP36对RPE细胞损伤的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RPE 细胞ARPE-19（上海澳音生物科技有限公司），杜氏改良依格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）培养基（美国Sigma 公司，D0697）；实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，4472908），凋亡检测试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司，JK8284），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）活性酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，A001-3-2、A003-1-2），双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，KFS303）。

酶标仪、实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo 公司，StepOneTM），流式细胞仪（美国Bio-Rad 公司，FACSCanto II）。

1.2 细胞处理与分组

根据ARPE-19细胞处理方法的不同，将细胞分为8 个组。（1）用含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基培养ARPE-19 细胞24 h，设为对照组（control group，CG）；（2）用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM 培养基培养ARPE-19 细胞24 h，设为高糖（high glucose，HG）组；（3）将circ_USP36 干扰表达载体（si-circ_USP36）及阴性对照（negative control，NC）分别转染至ARPE-19 细胞6 h，然后用30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM 培养基培养24 h，设为sicirc_USP36 组、si-NC 组；（4）将miR-326 模拟物及NC 分别转染至ARPE-19 细胞6 h，然后用30.0 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培养基培养24 h，设为miR-326 组、miR-NC 组；（5）将circ_USP36 干扰表达载体分别与miR-326 抑制剂（anti-miR-326）及NC 共转染至ARPE-19 细胞6 h，然后用30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM 培养基培养24 h，设为sicirc_USP36+anti-miR-326 组、si-circ_USP36+antimiR-NC组。

1.3 RT-qPCR 检测circ_USP36 和miR-326 的表达水平

提取各组ARPE-19 细胞的总RNA，合成cDNA后，严格按照试剂盒说明书的方法操作，进行RTqPCR 检测，相对表达量用2-△△Ct法计算，引物信息如表所示（表1）。

表1 引物信息

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞，漂洗2 次，加入500 μL 的结合缓冲液重悬，然后加入10 μL 的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI），混匀、避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 ELISA检测SOD活性和MDA含量

细胞培养48 h 后收集各组细胞，严格按照试剂盒说明书操作方法，使用ELISA 法检测SOD 活性和MDA含量。

1.6 双荧光素酶报告实验

通过在线数据库Starbase 预测显示circ_USP36与miR-326 存在结合位点。将circ_USP36 的野生型荧光素酶载体（WT-circ_USP36）和突变型荧光素酶载体（MUT-circ_USP36）分别与miR-NC 和miR-326 共转染至ARPE-19 细胞中，严格按照试剂盒说明书操作方法，在双荧光素酶检测系统对荧光素酶活性进行检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，本研究相关数据均为计量资料，且符合正态分布，采用均数±标准差（）表示，方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验，当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调circ_USP36 对高糖作用的ARPE-19 细胞凋亡、氧化应激的影响

4 组间ARPE-19 细胞的circ_USP36、miR-326、细胞凋亡率、SOD 活性、MDA 含量比较，差异均有统计学意义（Fcirc_USP36=701.534，FmiR-326=392.706，F凋亡率=212.635，FSOD=138.379，FMDA=237.624，均P=0.000）。

两两比较，（1）circ_USP36：与CG 组比较，HG 组的circ_USP36 表达升高（t=53.199，P=0.000）；与HG组和si-NC 组比较，si-circ_USP36 组circ_USP36 表达降低（tHG=29.919，tsi-NC=22.849，均P=0.000），差异均有统计学意义。（2）miR-326：与CG 组比较，HG 组miR-326 表达水平降低（t=65.818，P=0.000）；与HG组和si-NC 组比较，si-circ_USP36 组miR-326 表达水平升高（tsi-NC=14.241，tsi-circ_USP36=13.967，均P=0.000），差异均有统计学意义。（3）细胞凋亡率：与CG 组比较，HG 组细胞凋亡率升高（t=21.092，P=0.000）；与HG 组和si-NC 组比较，si-circ_USP36 组细胞凋亡率降低（tsi-NC=14.550，tsi-circ_USP36=13.725，均P=0.000），差异均有统计学意义。（4）SOD 活性：与CG组 比 较，HG 组的SOD 活性降低（t=15.362，P=0.000）；与HG 组和si-NC 组比较，si-circ_USP36 组SOD 活性升高（tsi-NC=12.571，tsi-circ_USP36=12.133，均P=0.000），差异均有统计学意义。（5）MDA 含量：与CG组比较，HG 组MDA 含量升高（t=22.867，P=0.000）；与HG 组和si-NC 组比较，si-circ_USP36 组MDA 含量降低（tsi-NC=14.174，tsi-circ_USP36=14.878，均P=0.000），差异均有统计学意义（图1、表2）。

表2 下调circ_USP36对高糖诱导ARPE-19细胞凋亡、氧化应激的影响（，n=3）

表2 下调circ_USP36对高糖诱导ARPE-19细胞凋亡、氧化应激的影响（，n=3）

注：*与CG组相比，P＜0.05；#与HG组相比，P＜0.05；&与si-NC组相比，P＜0.05；CG 对照组；HG 高糖组；si-NC 干扰表达载体阴性对照组；si-circ_USP36 circ_USP36干扰表达载体组；circ-USP36 环状RNA泛素特异性肽酶36；miR-326 微小核糖核酸-326

图1 下调circ_USP36对高糖诱导ARPE-19细胞凋亡的影响

2.2 circ_USP36和miR-326靶向关系验证

Starbase 数据库预测显示circ_USP36 和miR-326有互补序列（图2）。与miR-NC+WT-circ_USP36组（0.41±0.04）比较，miR-326+WT-circ_USP36 组（0.99±0.08）的荧光素酶活性降低，差异有统计学意义（t=11.232，P=0.000）；miR-NC+MUT-circ_USP36组（1.00±0.06）和 miR-326+MUT-circ_USP36 组（0.96±0.08）的荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 circ_USP36和miR-326的互补序列

2.3 miR-326 对高糖作用的ARPE-19 凋亡和氧化应激的影响

与miR-NC 组相 比，miR-326 组的miR-326 表达升高（t=41.254，P=0.000），ARPE-19 细胞凋亡率降低（t=17.547，P=0.000），SOD活性升高（t=8.413，P=0.001），MDA 含量降低（t=15.209，P=0.000），差异均有统计学意义（图3、表3）。

表3 miR-326对高糖诱导ARPE-19凋亡和氧化应激的影响（，n=3）

表3 miR-326对高糖诱导ARPE-19凋亡和氧化应激的影响（，n=3）

注：miR-NC 过表达载体阴性对照组；miR-326 miR-326 过表达载体组；miR-326 微小核糖核酸-326；SOD 超氧化物歧化酶；MDA丙二醛

图3 miR-326抑制高糖诱导的ARPE-19凋亡

2.4 抑制miR-326 对下调circ_USP36 处理的高糖作用的ARPE-19凋亡、氧化应激的影响

与si-circ_USP36+anti-miR-NC 组 相比，sicirc_USP36+anti-miR-326组的miR-326表达降低（t=33.486，P=0.000），ARPE-19 细胞凋亡率升高（t=9.096，P=0.001），SOD 活性降低（t=9.145，P=0.001），MDA 含量升高（t=12.360，P=0.000），差异均有统计学意义（图4、表4）。

表4 抑制miR-326对下调circ_USP36处理的高糖作用的ARPE-19凋亡和氧化应激的影响（，n=3）

表4 抑制miR-326对下调circ_USP36处理的高糖作用的ARPE-19凋亡和氧化应激的影响（，n=3）

注：si-circ_USP36+anti-miR-NC circ_USP36 干扰表达载体+抑制剂阴性对照组；si-circ_USP36+anti-miR-326 circ_USP36 干扰表达载体+miR-326抑制剂组；circ-USP36 环状RNA泛素特异性肽酶36；miR-326 微小核糖核酸-326

图4 抑制miR-326对下调circ_USP36处理的高糖作用的ARPE-19凋亡的影响

3 讨论

DR 是由糖尿病引起的眼部常见的并发症，严重威胁患者视力，其发病机制复杂，高血糖是公认的主要危险因素[9]。RPE 细胞的氧化应激和细胞凋亡造成的损伤与糖尿病视网膜病变的发生发展密切相关[10-11]。研究RPE 细胞损伤机制，可为靶向精准治疗DR 开辟新希望。因此，本实验使用高葡萄糖诱导RPE 细胞建立损伤模型。结果显示，高糖诱导的ARPE-19细胞的细胞凋亡率升高，SOD 活性降低，MDA 表达升高，差异均有统计学意义。SOD 是重要的抗氧化酶之一，其活性高低及脂质过氧化产物MDA 含量的多少是衡量抗氧化状态的重要指标[12]，本研究结果说明高糖可诱导RPE 细胞氧化损伤。

有研究[13-14]表明，许多miRNA 参与调控细胞氧化应激及细胞损伤过程，是DR 的潜在靶点。据报道[15]，miR-326 通过抑制Krüpple 样因子7（Krüpplelike factor 7，KLK7）介导的丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制帕金森病中的细胞凋亡并促进多巴胺能神经元的增殖；miR-326-5p 上调可增强细胞活力、抑制神经细胞凋亡和氧化应激，并减轻线粒体损伤[16]。本实验结果显示，高糖诱导的ARPE-19 细胞中miR-326 表达水平降低，提示miR-326 可能与高糖诱导的ARPE-19 细胞损伤有关。进一步过表达miR-326 后，发现ARPE-19 的细胞凋亡率降低，SOD 活性升高，MDA 表达降低，说明过表达miR-326 可降低高糖诱导的ARPE-19 细胞的氧化应激和凋亡。

有研究[17]报道敲除circ_USP36 通过调节miR-182-5p/Krüpple 样 因 子5（Krüpple-like factor5，KLF5）轴减轻ox-LDL 介导的人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells，HUVSMC）损伤。沉默circ_USP36 通过miR-942-5p/组蛋白去乙酰化酶9（histone deacetylase 9，HDAC9）轴抑制了ox-LDL 处理的HUVEC 的细胞凋亡、氧化应激和炎症[18]。本实验结果显示，高糖诱导的ARPE-19 细胞中circ_USP36 表达水平升高；下调circ_USP36 后，ARPE-19 细胞凋亡率降低，SOD 活性升高，MDA 表达降低，表明下调circ_USP36 可减轻高糖诱导的ARPE-19 细胞的氧化应激和凋亡。且本实验还发现circ_USP36 靶向调控miR-326；而抑制miR-326可逆转下调circ_USP36 对ARPE-19 细胞损伤的作用。

综上所述，下调circ_USP36 可通过靶向调控miR-326 减缓高糖诱导的RPE 细胞凋亡和氧化损伤。研究中关于circ_USP36 可通过调控miR-326进而调控下游mRNA 表达的机制研究，还需要后续进行深入探讨。