兰可心 ，张学炜 ，郑璐璐 ，王 敏 ，崔茂盛

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300380；2.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381）

近年来，随着胚胎工程相关技术研究和应用的不断发展，研究者越来越需要数量更多的高质量卵母细胞以满足试验和科研需求。早期研究已表明，卵巢在其保存运输过程中的质量对卵母细胞成熟和后期发育潜力具有重要影响。目前获取卵巢的方式主要有体内和体外两种，体内获取操作复杂、成本高、耗时长、成功率低，而体外获取主要是从屠宰场收集卵巢，该方法操作简单、成本低、速度快、数量足。因此，体外卵巢已经成为科研人员开展胚胎工程相关研究的主要获取方式。现实情况下，运输距离远、生猪养殖和屠宰区域限制等等原因往往导致卵巢从离体到送达实验室时间较长，这对卵巢保存技术提出了更高要求。Matías Nicolás Tellado、Pim Pra Par等报道，猪卵巢35℃保存条件下，随着保存时间延长，卵泡液会因微环境酸化引起卵母细胞中毒，对体外成熟卵母细胞的氧化状态和体外受精胚胎发育能力造成负面影响。Kamoshita K等将小鼠卵巢在不同温度下保存24 h发现，保存在4℃条件下的卵巢组织结构异常变化率显著低于保存在14℃和37℃条件下的卵巢。上述前人实验表明，卵巢在体外保存过程中，不同温度对卵巢保存效果具有较大影响，并进一步影响着卵泡质量和卵母细胞成熟及发育潜力。

然而，目前有关卵巢保存技术的研究报道不多，特别是不同温度下对猪卵巢保存效果的探讨。本研究综合运用免疫荧光染色、酶联免疫吸附试验和基因表达技术，深入探讨了4℃下不同保存时间对猪卵母细胞成熟质量及发育潜力的影响。本研究结果对卵巢体外保存相关技术的理论研究和实践操作均具有重要的指导意义。

1 材料和方法

1.1 实验设计

本实验所用卵巢从屠宰场获取，设计了卵巢在4℃条件下保存6 h、18 h和24 h对卵巢内卵母细胞成熟质量、氧化凋亡水平及相关基因mRNA表达水平的影响。本实验以0 h为对照组，每组实验均重复3次。

1.2 试剂和药品

M199（美国Gibco公司）；1×PBS（SolarBio）；DNA/RNA提取试剂盒（TACO）；mRNA反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒（TAKARA)；无特殊说明的情况下，细胞培养所需其他试剂均购自Sigma公司。

1.3 卵母细胞收集、体外成熟和孤雌培养

卵巢取自天津市某屠宰场，置于37℃装有0.9%NaCl溶液（含青链霉素）的保温瓶中，并于2 h内运到实验室。用含0.1%青链霉素的PBS溶液清洗3～5次后放置到4℃恒温箱中避光保存。每组15个卵巢，分别在保存0 h（对照组）、6 h、18 h和24 h后各取出3个卵巢用于以下实验研究。使用10 mL注射器，从卵巢表面抽取卵泡直径大小为3.0～8.0 mm的透明卵泡。在体视显微镜下，使用口吸管挑出包裹3层以上卵丘细胞的卵母细胞，放置于四孔板中，在39℃、5%CO2、完全湿度培养箱中进行成熟培养44 h。44 h后使用透明质酸酶脱掉透明带外的卵母细胞，放入1 mm宽的激活仪融合槽，使用激活参数105V-30us-1次脉冲进行激活。激活完成后移入PZM-3发育液进行后续孤雌发育。

1.4 猪卵母细胞卵丘扩展

体外培养44 h成熟后，使用倒置荧光显微镜（日本，Nikon）观察并拍照COCs，检测分析卵丘扩展指数。卵丘扩展指数（Cumulus Expansion Index，CEI）标准如下：0级：扩展不连续；1级：扩展1-2层；2级：呈放射状，外层约一半扩展；3级：除放射冠外全部扩展；4级：全部扩展；CEI=（0级COCs个数×0＋1级COCs个数×1＋2级COCs个数×2＋3级COCs个数×3＋4级COCs个数×4）总COCs个数。

1.5 卵母细胞ROS及DNA片段化水平检测

将脱去卵丘细胞的卵母细胞在0.1%PVA-PBS液中清洗3次后，进行如下染色试验。 1）活性氧染色：卵母细胞在含有2′7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针（碧云天，S0033S，1∶1 000）的0.1%PVA-PBS中于37℃条件下避光孵育15 min。然后在倒置荧光显微镜下选择激发波长为488 nm，发射波长为525 nm的滤光片定性观察胞质内活性氧含量。2）DNA片段化检测：采用原位末端转移酶标记技术进行检测（碧云天，C1086）；操作步骤：a.4%多聚甲醛室温固定30 min，b.0.3%Triton X-100室温通透5 min，c.荧光染液（荧光标记液∶TdT酶=9∶1）37℃孵育60 min。孵育结束后用0.1%PVA-PBS充分去除多余染液，压片。在倒置荧光显微镜下拍照，激发波长范围为450～500 nm，发射波长范围为515～565 nm（绿色荧光），实验全程避光。

1.6 卵丘细胞总抗氧化能力及脂质氧化水平检测

将挑出卵母细胞的卵丘细胞离心后，进行如下实验。总抗氧化能力检测：将卵丘细胞在冰浴充分震荡裂解，通过测定Fe3+还原能力来测定（Solarbio，BC1315）。按照试剂盒说明配置标准溶液。样品测定管：混合液180 μL、蒸馏水18 μL、细胞上清液6 μL。设置空白孔，室温反应10 min，放置酶标仪内，测定593 nm时的吸光值。脂质氧化水平检测：通过丙二醛（MDA）含量来反应脂质氧化水平（Solarbio，BC0025）。样品检测工作液配制：依次加入300 μL检测工作液、100 μL样本和100 μL试剂三。100℃水浴锅孵育60 min后，立即放置冰盒上降至常温。10 000 g，离心10 min。取上清200 μL放置96孔板中，测定在532 nm和600 nm的吸光度。每组样本重复3次。

1.7 卵丘卵母细胞复合体（COCs）基因mRNA表达水平

采用RT-qPCR技术，分析各组抗氧化基因（NRF-2、CAT、SOD）、凋亡基因（BAX）、抗凋亡基因（Bcl-2）、缝隙连接蛋白基因（CX37、CX 43、CX 45）的mRNA表达水平。引物序列见表1。使用全自动核酸提取试剂盒（TACO）提取COCs内总RNA，将1 000 ng总RNA反转录成cDNA。RT-qPCR反应设置95℃预变性3 min，95℃变性15 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s（39个循环），最后72℃延伸5 min，每个样品每次设3个复孔。内参基因为GAPDH。

表1 引物序列

1.8 统计分析

ROS水平及DNA片段化水平用荧光显微镜拍照片后使用Image J 180分析荧光强度。目的基因相对表达水平采用2-ΔΔct法计算。所有数据应用SPSS 25.0统计软件进行单因素ANOVA 分析，所有数据以平均值±标准误表示。P＜0.05 表示差异显著。使用Graphpad Prism 9软件绘图。

2 结果分析

2.1 猪卵巢于4℃保存后对卵母细胞发育能力的影响

4℃保存猪卵巢对卵母细胞成熟及发育潜力如表2所示。

表2 4℃保存猪卵巢对卵母细胞成熟及发育潜力

表2总结了在4℃保存猪卵巢0 h、6 h、18 h及24 h后，体外成熟44 h对卵母细胞存活率及成熟率的影响。与对照组（0 h）相比，当保存时间延长到6 h、18 h及24 h后其存活率及成熟率均显著降低。随着时间增加，未经过保存0 h组的存活率及成熟率均显著高于6 h组（96.51±0.07vs38.44±4.54；68.78±3.15vs6.00±1.76；P＜0.05），且前两组也均高于18 h组和24 h组（26.89±2.78vs14.67±1.33；0.00±0.00vs0.00±0.00；P＜0.05）。各组之间存活率差异性显著，而18 h组和24 h组成熟率无显著差异（0.00±0.00vs0.00±0.00）。

由表3可知，将成熟卵母细胞孤雌激活后记录孤雌卵裂率及囊胚率。对照组孤雌卵裂率及囊胚率显著高于实验组（76.67±3.33），且随着保存时间延长，各组卵裂率及囊胚率显著降低。18 h组相对于6 h组卵裂率显著降低（0.00±0.00vs3.33±3.33；P＜0.05），且与24 h组无显著差异。6 h组囊胚率相对于对照组显著降低（0.00±0.00vs26.67±3.33；P＜ 0.05），而与18 h和24 h组无显著差异（0.00±0.00vs 0.00±0.00）。

表3 4℃保存猪卵巢对卵母细胞孤雌卵裂及囊胚数

2.2 猪卵巢于4℃保存对卵母细胞ROS含量及DNA片段化水平的影响

4℃保存对卵母细胞活性氧含量以及DNA片段化影响如图1所示。

图1 4℃保存对卵母细胞活性氧含量以及DNA片段化影响

使用免疫荧光染色来检测卵母细胞内活性氧及DNA片段化水平，以此反应卵母细胞氧化和凋亡的程度。活性氧含量以及DNA片段化水平均随着保存时间的延长逐渐升高。如图2 A所示，0 h组、6 h组、18 h组及24 h组的活性氧含量均显著升高（3.17±0.04vs9.06±0.41vs 11.99±0.36vs14.97±0.26；P＜0.05）。DNA片段化水平在0 h组、6 h组、18 h组显著升高（0.09±0.07vs3.43±0.34vs 7.69±0.44；P＜0.05）。18 h组和24 h组之间无显著差异（8.86±0.06，图2B）。

2.3 猪卵巢于4℃对卵丘细胞扩展指数、总抗氧化能力和丙二醛含量的影响

猪卵巢于4℃对卵丘细胞扩展指数、总抗氧化能力和丙二醛含量的影响如图2所示。

使用酶联免疫检测仪来检测卵丘细胞内T-AOC及MDA含量，以此反应卵丘细胞总抗氧化能力和脂质氧化（MDA）的程度。如图2A所示，活性氧含量以及DNA片段化水平均随着保存时间的延长逐渐升高。0 h组、6 h组、18 h组及24 h组的脂质氧化含量均显著升高（1.26±0.04 vs 1.26±0.04 vs 2.07±0.04vs2.20 ±0.01；P＜0.05）。相对于对照组，总抗氧化能力水平在6 h组、18 h组显著升高（3.65±0.05vs2.53±0.02vs1.62±0.01；P＜0.05）。而18 h组和24 h组之间无显著差异（1.52±0.00）。

图2 A: 卵丘扩展指数 B: 总抗氧化能力 C: 丙二醛（MDA）含量

2.4 猪卵巢于4℃对卵丘卵母细胞复合体相关基因mRNA表达的影响

猪卵巢于4℃对卵丘卵母细胞复合体相关基因mRNA表达的影响如图3所示。

使用RT-PCR测定相关基因表达量，如图3所示，与对照组相比，抗氧化基因CAT、SOD、NRF-2（图3，A）、抗凋亡基因Bcl-2（图3，C）、缝隙链接蛋白CX37、CX45、CX43（图3，B），随着时间延长，表达显著降低（P＜0.05）。而凋亡基因Bax表达量显著上升（P＜0.05）。从Bcl-2/Bax比值可看出，随着保存时间的延长逐渐降低，对照组显著高于试验组，而6 h组和18 h组相对24 h组显著升高，而组间无显著差异。

图3 A:抗氧化基因CAT、SOD、NRF-2的基因表达。B: 缝隙链接蛋白CX37、CX45、CX43的基因表达。C: 抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax的基因表达。D: Bcl-2/Bax比值

3 讨论

随着以胚胎工程为核心的现代生物技术研究与应用的发展，对高质量卵子的需求量越来越大。作为卵母细胞的储备器官及生长发育的组织，卵巢的获取与保存运输也愈发重要。目前，国内外开展的胚胎生物工程相关研究所需的卵巢大多都从猪屠宰场获得。理论上说，这些从屠宰场获得的离体卵巢越早送达实验室，从其中获得的卵母细胞成熟质量和后期发育潜力也越高。开展离体卵巢长时间高质量保存相关技术研究，不仅可以为远距离、长时间运输卵巢提供技术支撑，也对动物种质资源保护具有重要意义。

大量文献资料显示，从屠宰场获得卵巢最好在2～4 h内送达实验室。然而，由于道路交通、屠宰场距离以及当地生猪养殖与屠宰政策等等因素，往往导致卵巢到达实验室的时间较长。如果卵巢在运输过程中保存不当，比如温度过高、过低以及保存液pH变化等等，均可能造成保存过程中卵巢的一些异常变化，从而影响卵巢内卵母细胞的体外成熟质量和胚胎发育潜力。目前有关卵巢保存技术的研究不多，缺乏对猪卵巢保存过程中的影响因素及其作用机理的探讨。

本研究较为系统地探讨了将猪卵巢在4℃保存不同时间后对卵母细胞质量及卵丘细胞的氧化凋亡水平的影响，并从发育潜力、生化水平和相关抗氧化基因表达层面对其影响机理做了初步探讨。大量实验室使用4℃来用作器官低温保存的选择，低温能有效地减少组织代谢以及缺血造成的损伤；卵巢在4℃下长期保存可能会改变体外成熟过程中参与调节卵母细胞抗氧化防御系统的其他酶的活性。需要进一步评估以提高对从冷藏卵巢中回收的卵母细胞的氧化还原状态的认识。基于上述理论基础，本研究选择了4℃保存条件下，探讨保存6 h、18 h和24 h对卵母细胞体外成熟、成熟质量以及胚胎发育潜力的影响。本研究结果显示，随着保存时间的不断延长，本实验中在4℃条件下保存的卵巢内卵母细胞的发育潜力、卵丘扩展、总抗氧化能力、抗氧化基因CAT、NRF-2、SOD、抗凋亡基因Bcl-2、和缝隙链接蛋白CX37、CX45、CX43的mRNA表达水平也随之降低，凋亡基因Bax显著升高，与保存时间成正相关。当保存时间达到6 h时，卵母细胞的存活率仅达到38.44%，而囊胚率仅为0%。有报道称，猪卵巢离体后组织液的酸化是导致卵母细胞成熟质量低和后期发育能力差的原因之一。Luu Vien Viet等比较猪、牛、猫卵巢在4℃下贮藏5 d后的细胞核以及卵母细胞损伤的动力学变化，指出低温保存显著降低了成熟前的猪和牛生发囊泡期的卵母细胞的比例。当4℃下保存时间超过24 h后，没有猪卵母细胞达到第一次减数分裂的中期，与本文的实验结果较为一致。而也有一些不同的报道，如Anna Rita Piras等报道，家猫卵巢在4℃条件下保存24 h时，仅会降低部分卵巢腔前卵泡数量，随着保存时间延长，卵巢内卵泡结构受损程度加重，并影响卵母细胞的氧化状态及体外受精能力。在4℃保存条件下，该研究在家猫上的保存效果优于本研究在猪上的保存效果，这可能与不同物种细胞对温度敏感性差异有关。有报道指出，猪卵母细胞，特别是种质细胞对低温较为敏感，低温变化更容易对猪卵母细胞和精子造成不可逆损伤。在不同动物上的研究结果也不尽一致，LinY-A等人对猪卵巢体外保存的研究结果表明，当保存时间为8 h，其最佳保存温度约为25℃。而Alicia Martín-Maestro等认为，当绵羊卵巢在30℃保存超过7 h时，卵母细胞成熟质量及发育潜力均大幅度降低。但王锋等报道却指出，用接近牛体温39℃温度保存6 h可以维持正常代谢水平，对卵巢的保存更有利。

本实验探讨了卵巢在4℃保存条件下，保存时间为6 h、18 h及24 h时对猪卵巢内卵母细胞发育潜力及质量水平的影响。并从体外成熟能力、胚胎发育潜力、抗氧化水平以及相关基因表达水平等不同层面对影响机理做了初步探讨。本文实验结果表明，保存温度对卵巢内卵母细胞质量有直接影响。当猪在4℃保存时间长于6 h时，卵母细胞质量严重下降。本实验结果为后人开展卵巢保存相关研究提供了有益的理论和实践指导。

4 结论

本文研究了解了卵巢储存对未成熟卵母细胞生理特征的影响。结果已经证明，随着保存时间的延长，在4℃保存猪卵巢对体外成熟的卵母细胞的氧化状态及其发育能力产生负面影响，当保存时间达到6 h时成熟率及囊胚率显著降低。这些结果为冷藏对腔前卵泡卵母细胞的影响提供了额外的信息。需要新的策略来评估保存或挽救储存的卵母细胞发育潜力的可能性，以成功生产高质量胚胎。