◎ 陈春艳，李 姣

（火箭军工程大学，陕西 西安 710038）

柑橘是被子植物门、双子叶植物纲、芸香目植物，在温暖湿润气候地方大量种植。柑橘中富含柚皮苷，这既是柑橘苦味的主要来源，同时也是柑橘中的药用有效成分。本研究拟采用超高效液相色谱分析检测汉中柑橘叶中的柚皮苷，得出柑橘叶中这种功能物质的含量，评价柑橘叶是否具有分离提纯柚皮苷的开发利用价值，为柑橘的综合利用提供基础研究数据[1-3]。柚皮苷，又为柚苷（柚皮甙），是一种双氢黄酮类化合物，通过查阅文献可知柚皮苷类化合物主要集中分布在果皮、果汁和果核中，含量仅为1%～5%[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘叶样品（柑橘园现摘）洗净，经烘箱60 ℃烘干、粉碎，过60目分样筛，备用。

柚皮苷标准品（纯度为98.7%），上海同田生物技术股份有限公司；甲醇（分析纯），天津市登峰化学试剂厂；乙腈（色谱纯），Burdick and Jackson公司；纯水，杭州娃哈哈矿泉水。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY-UPLC带PDA检测器，美国Waters公司；SHIMADZU AUY220万分之一电子天平、SHIMADZU AUW220D十万分之一电子天平，日本岛津公司；KQ100-DA超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；101-3A电热恒温鼓风干燥箱，沪南电炉烘箱厂；ZN-02中草药粉碎机，北京兴时利和科技发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 检测波长的选择

取适当浓度的柚皮苷标准品溶液，在Waters ACQUITY PDA检测器下进行光谱扫描，选择检测波长。

1.3.2 样品溶液制备

称取柑橘叶1.00 g于100 mL的三角烧瓶中，加20 mL甲醇，超声振荡40 min，过滤溶液于50 mL容量瓶中，残渣用10 mL甲醇再提取2次，合并提取液并用甲醇定容，用0.22 μm有机滤膜过滤后上机检测。

1.3.3 标准品溶液的制备

精密称取柚皮苷标准品2.6 mg，用甲醇溶解并定于10 mL的容量瓶，得到260 μg·mL-1的柚皮苷标准母液。分别取柚皮苷母液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为 2.6 μg·mL-1、5.2 μg·mL-1、10.4 μg·mL-1、20.8 μg·mL-1和 26.0 μg·mL-1的标准品溶液。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.5 mm，1.7 µm）； 流 动 相：A为 乙腈，B为纯水；采用梯度洗脱：0～1 min，10% A，1～5 min，40% A，5～6 min，10% A；检测波长：288 nm；流速：0.3 mL·min-1，进样量：5 µL，柱温：30 ℃。

2 结果与分析

2.1 波长的确定

在Waters ACQUITY PDA检测器下对柚皮苷进行光谱扫描，结果如图1所示。为保证实验的灵敏度和被测组分的准确性，经参考其他文献，本实验在288 nm波长处进行检测[5]。

图1 柚皮苷的紫外扫描图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围考察

柚皮苷标准品溶液分别经0.22 µm微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件依次进样5 μL，测定其各自色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准工作曲线[14]。柚皮苷标准品色谱图见图2。标准曲线回归方程为Y=155.113X-793.126，r=0.998 947，表明柚皮苷在2.6～26.0 μg·mL-1线性关系良好。

图2 柚皮苷的标准色谱图

2.2.2 精密度考察

取同一柑橘叶样品，按上述方法制备样品，在上述色谱条件下平行测定5次，每次进样5 µL，测定橙皮苷的峰面积，计算相对标准偏差（RSD）考察方法的精密度。测得柚皮苷的峰面积分别为13 393.9、12 186.6、12 588.7、13 156.5和13 045.2，计算得到其相对标准偏差（RSD）为3.75%；RSD＜5.0%，表明在该条件下方法精密度良好。

2.2.3 稳定性考察

取同一柑橘叶试样，在上述色谱条件下，分别于0.5 h、1.0 h、6.0 h、12.0 h和 24.0 h进样 5 µL检测柚皮苷的峰面积，计算相对标准偏差（RSD），以考察方法的稳定性。测得柚皮苷的峰面积分别为12 623.7、12 735.8、12 977.4、12 895.6和12 932.5，计算得其相对标准偏差（RSD）为1.16%；RSD＜3%，表明在该条件下方法稳定性良好。

2.2.4 重复性考察

取5个柑橘叶样品，按上述方法制备样品，在上述色谱条件下测定，每个样进样5 µL，测定橙皮苷的峰面积，计算相对标准偏差（RSD）考察方法的重复性。测得5个柑橘叶中柚皮苷的峰面积分别为12 286.5、12 347.8、12 154.7、12 433.2和12 154.1，计算得其相对标准偏差（RSD）为0.99%；RSD＜3%，表明在该条件下重复性良好。

2.2.5 回收率考察

精密称取已测定柚皮苷含量为4.2 mg·kg-1的柑橘叶试样1.0 g，加入260.0 µg·mL-1的标准品母液2 mL，按上述方法制备平行制备3个样品，在上述色谱条件下进行检测，计算该方法的回收率。柚皮苷回收率实验结果见表1，该分析方法的平均回收率为99.35%，表明方法准确性良好；回收率的RSD为4.03%＜5%，表明该回收率实验稳定性、重复性良好，该检测结果可信。

表1 柚皮苷回收率实验结果表

2.3 样品溶液的测定

样品溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，上机检测，色谱图见图3。由标准品色谱图可知2.51 min峰为柚皮苷。

图3 柑橘叶中柚皮苷分析色谱图

3 结论

本文以柑橘叶为原料，采用超高效液相色谱对其中的柚皮苷进行定性、定量分析，为柑橘叶的综合利用提供准确的信息。柑橘叶子全年不凋零，若其中柚皮苷含量高且稳定，就可全年批量生产提取，更好地研究利用柑橘叶中柚皮苷。