姚永谋，张远芳，刘芳，方会龙，刘青，刘泽，王俊杰，黄建华

（1.湘南学院药学院，湖南 郴州 423000；2.湘南学院基础医学院，湖南 郴州 423000；3.湘南学院护理学院，湖南 郴州 423000）

积雪草为伞形科植物积雪草［Centella asiatica（L.）Urb.］的干燥全草，用于湿热黄疸、中暑腹泻、石淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤［1］。在我国主要分布于华东、华南、中南及西南等地［2］。积雪草主要含有三萜及其苷类、挥发油、黄酮类、生物碱等化合物［3］，积雪草总苷作为其主要药用活性成分近年来被研究的比较多，其中积雪草苷具有神经保护、抗肿瘤、抗缺血再灌注损伤、抗支架再狭窄、保护肺脏等多方面作用［4］，羟基积雪草苷在临床上被用于抗炎抗氧化、抗抑郁症、抗肿瘤、皮肤增白、治疗烧伤性瘢痕、增强记忆、防治冠心病、心肌梗死、脑血栓、脑梗死等［5-6］。目前对于积雪草中积雪草总苷等有效成分的脱色研究主要采用的是活性炭脱色，常用于化妆品工业中［7］。最近也有文献报道氧化铝对积雪草有效成分也具有脱色效果［8］，但这些研究内容均不够详细充分或者只对羟基积雪草苷等单一成分进行了相关研究，而积雪草提取物含有的成分较多，影响其脱色等品质提升的因素也较多，关于积雪草总苷提取物的脱色研究笔者尚未见到相关报道。因此，本文在已有研究基础上，以脱色率为主要考察指标，结合积雪草总苷含量和回收率等结果，利用响应面法［9-10］进一步研究中性氧化铝对积雪草总苷提取物的脱色效果，并对中性氧化铝用量、温度、时间以及pH值等影响条件进行优化，以期得到最优的脱色条件。本研究可以为积雪草提取物的品质提升和开发利用提供一定的参考依据。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

2020年采自于湖南省郴州市苏仙区白露塘地区的积雪草原料，经湘南学院王俊杰教授鉴定为伞形科植物积雪草［Centella asiatica（L.）Urb.］的干燥全草，经干燥破碎后，进行乙醇回流提取，提取物再经硅胶柱分离得到棕黄色的积雪草提取物粉末，其中积雪草总苷含量为65.4%，羟基积雪草苷为42.0%，积雪草苷为23.3%。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1260 InfinityⅡ液相色谱仪（美国Agilent公司）；AUW120D分析天平（岛津仪器有限公司）；KQ-600DE超声清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；RCT-B-S25恒温磁力搅拌器（德国IKA公司）；UVmini-1280紫外分光光度计（岛津仪器有限公司）；SHZ-DⅢ循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

羟基积雪草苷（纯度＞98%，批号：PRF8032843，成都普瑞法科技开发有限公司）；积雪草苷（纯度＞98%，批号：PRF7082702，成都普瑞法科技开发有限公司）；95%乙醇（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司）；怡宝纯净水（市购）；中性氧化铝（100～200目，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 原料脱色

准确称取0.2 g积雪草提取物粉末，用10 mL 50%乙醇超声溶解，然后加入一定量过100～200目筛的中性氧化铝粉末，并在一定的温度、时间以及pH值等条件下进行搅拌脱色得到脱色溶液，经浓缩干燥后得到脱色产品。

2.2 脱色率的计算

取脱色溶液用50%乙醇稀释150倍后在204 nm波长下用紫外分光光度计测定吸光度，扣除溶剂背景后计算脱色率。

脱色率［11］=（脱色前吸光度-脱色后吸光度）/脱色前吸光度×100%。

2.3 单因素试验设计

采用中性氧化铝用量、脱色温度、脱色时间、pH值作为考察因素，根据“2.1”项操作进行单因素试验，考察4个因素对积雪草总苷提取物脱色效果的影响。

2.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，进一步以X1（中性氧化铝用量）、X2（脱色时间）、X3（脱色温度）、X4（pH值）为考察因素，应用Design-Expert 11软件进行Box-Behnken试验设计，选择合适的响应面因素和水平，以脱色率为响应值，设计四因素三水平的响应面试验，如表1所示。

表1 响应面试验因素水平Tab.1 Response surface test factor level

2.5 含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备

精密称取积雪草苷4.25 mg、羟基积雪草苷7.86 mg置于同一个5 mL容量瓶中，加入色谱纯甲醇超声溶解后定容至刻度，即得1 mL中分别含积雪草苷0.85 mg、羟基积雪草苷1.572 mg的对照品混合溶液。

2.5.2 供试品溶液的制备

精密称取积雪草提取物粉末与脱色后的干燥产品各20 mg分别置于25 mL容量瓶中，加入色谱纯甲醇超声溶解后定容至刻度，混匀后过0.45 μm微孔滤膜，得供试品溶液。

2.5.3 色谱条件

采用岛津InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以甲醇：乙腈：水（24：26：50）为流动相；等度洗脱，流速为0.8 mL/min；检测波长为204 nm；进样量为10 μL。对照品和积雪草提取物样品色谱图见图1。

图1 积雪草苷、羟基积雪草苷的对照品（A）和样品（B）色谱图Fig.1 Chromatogram of control substances（A）and samples（B）of asiaticoside and madecassoside

2.5.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.5.1”项下对照品混合溶液0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.0 mL到10 mL容量瓶中，加入色谱甲醇定容至刻度，摇匀后按“2.5.3”项下色谱条件进行测定，记录各色谱峰面积。以对照品峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）进行回归分析，得到积雪草苷、羟基积雪草苷的线性方程见表2，结果表明2个成分在各自的线性范围内均呈良好的线性关系。

表2 积雪草苷与羟基积雪草苷的线性关系考察Tab.2 The linearity of asiaticoside and madecassoside

2.5.5 精密度试验

精密吸取“2.5.1”项下对照品混合溶液10 μL，按“2.5.3”项色谱条件连续进样6次，经测定积雪草苷、羟基积雪草苷峰面积的相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）分别为1.33%、0.32%，表明仪器的精密性良好。

2.5.6 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液（“2.5.2”项下的积雪草提取物溶液），按“2.5.3”项色谱条件分别在0、4、8、12、16、24 h进行测定，得到样品中积雪草苷、羟基积雪草苷峰面积的RSD分别为0.76%、0.61%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.7 重复性试验

称取该积雪草提取物粉末6份，按“2.5.2”项下的方法制备得到6份供试品溶液，再按“2.5.3”项色谱条件进行测定分析，结果测得样品中积雪草苷、羟基积雪草苷含量的RSD分别为1.03%、1.85%，表明该方法重复性良好。

2.5.8 样品回收率试验

精密称取该积雪草提取物粉末6份，分别精密加入不同量的积雪草苷、羟基积雪草苷对照品，按“2.5.2”项下的方法制备供试品溶液，取对照品溶液和供试品溶液，依次进样10 μL，记录峰面积，按外标法计算含量，并分别计算两种成分的回收率。分别得到积雪草苷的平均回收率为99.50%，RSD=1.54%（n=6），羟基积雪草苷的平均回收率为102.10%，RSD=1.01%（n=6）。

2.5.9 样品测定

称取“2.1”项下得到的脱色产品，按照“2.5.2”项方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下的色谱条件进行测定色谱峰面积，并计算样品中积雪草苷、羟基积雪草苷的含量。

3 结果

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 脱色时间对积雪草提取物脱色效果的影响

积雪草提取物溶液在40℃，pH=7下加入0.8 g中性氧化铝粉末，分别保温脱色10、15、20、25、30 min时，得到的脱色效果如图2A所示。由图中可知，随着脱色时间的增加，积雪草提取物的脱色率呈先上升后趋于平缓趋势，其中当脱色时间分别为10、15、20、25、30 min时，得到的脱色溶液颜色依次为黄色、黄色、淡黄色、略显淡黄色、略显淡黄色，且25 min与30 min的脱色时间对积雪草提取物的脱色效果相差不明显，为节约时间，选择脱色时间为25 min。

3.1.2 脱色温度对积雪草提取物脱色效果的影响

积雪草提取物溶液在pH=7下加入0.8 g中性氧化铝粉末，分别在脱色温度为25℃、30℃、40℃、50℃、60℃时保温脱色25 min，得到的脱色效果如图2B所示，由图中可知随着脱色温度的增加，积雪草提取物的脱色率呈先上升后下降趋势，其中当脱色温度分别25℃、30℃、40℃、50℃、60℃时，得到的脱色溶液颜色依次为淡黄色、淡黄色、略显淡黄色、接近无色、接近无色。结合脱色温度为50℃时积雪草提取物的脱色率最高，因此选择脱色温度为50℃。

3.1.3 PH值对积雪草提取物脱色效果的影响

积雪草提取物溶液在50℃，分别在pH为5、6、7、8、9时加入0.8 g中性氧化铝，保温脱色25 min，得到的脱色效果如图2C所示。由图中可知随着pH值增加，积雪草提取物的脱色率呈下降趋势。其中pH值为5、6、7、8、9时，得到的脱色溶液颜色依次为无色、无色、接近无色、淡黄色、黄色。且pH值为5与6时对积雪草提取物的脱色效果相差不明显，从条件的温和程度和对设备的要求来看，选择pH值为6。

图2 不同因素对积雪草提取物脱色效果的影响Fig.2 Effects of different factors on the decolorization of C.asiatica extract

3.1.4 中性氧化铝用量对积雪草提取物脱色效果的影响

积雪草提取物溶液在50℃，pH=6下分别加入0.2 g、0.4 g、0.8 g、1.6 g、3.2 g中性氧化铝粉末时，保温脱色25 min，得到的脱色效果如图2D所示。由图中可知，随着中性氧化铝用量增加，积雪草提取物的脱色率呈上升趋势，其中当中性氧化铝用量分别为0.2 g、0.4 g、0.8 g、1.6 g、3.2 g时，得到的脱色溶液颜色依次为棕黄色、黄色、接近无色、无色、无色。可以看出积雪草提取物的脱色率与中性氧化铝的用量呈正相关，但实验中发现中性氧化铝的用量越多，积雪草提取物中的积雪草总苷成分的损失也越明显，综合考虑选择中性氧化铝粉末用量为1.6 g，即积雪草提取物的8倍量。

3.2 响应面试验结果与分析

3.2.1 响应面试验结果

根据响应面实验得到的积雪草提取物的脱色结果如表3所示。从表中数据可知，脱色率最高的为试验8，并结合脱色后总苷含量与总苷回收率等多个指标，采用了综合权重评分方法确定最优的脱色条件。其中综合权重评分=（脱色率×50%+总苷含量×25%+总苷回收率×25%），经评分得到表中最优的脱色条件为中性氧化铝1.6 g、脱色温度50℃、脱色时间25 min、pH为6，这与单因素试验的结果基本吻合，说明该响应面设计的29个试验点可信度较高。

3.2.2 回归模型的方差分析

利用Design-Expert 11软件对表3中脱色率数据进行回归分析，因总苷含量和总苷回收率数据无统计学意义，只需对脱色率数据进行分析，得二次多元回归方程：脱色率Y=40.17+15.46X1+1.07X2+2.11X3-4.22X4-4.11X1X4-4.28X2X3-。

表3 响应面试验结果Tab.3 The result of the response surface test

从表4中数据可知，该回归模型P＜0.0001，表明该回归模型有统计学意义，而失拟项P＞0.05不显著，同时R2=0.9499与Radj2=0.8998都接近1，表明该模型的可信度较高，对试验的拟合度较好，从而该回归方程可代替实际值对试验结果进行分析。另外从X1（中性氧化铝的用量）与X4（pH值）对积雪草提取物的脱色效果的影响都极显著，且结合F值可判断4种因素对脱色效果的影响顺序为：X1（中性氧化铝的用量）＞X4（pH值）＞X3（脱色温度）＞X2（脱色时间）。

表4 回归方程方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression equation

3.2.3 两因素交互影响的响应面分析

对脱色时间、中性氧化铝的用量、脱色温度、pH值四因素进行交互作用分析的结果如图3所示。依据响应面的坡度和等高线的形状，从图中可知，中性氧化铝用量的响应面坡度最陡，pH值次之，再者是脱色温度，脱色时间最缓。中性氯化铝用量与pH值的等高线不呈圆形，交互作用很显著，而脱色时间与脱色温度的等高线呈圆形，交互作用不显著。分析其原因可能主要是中性氧化铝作为一种常用的吸附性脱色材料，其作用类似于活性炭，用量与脱色效果呈正相关；同时积雪草提取物中除了主要的积雪草总苷成分外，可能还有酚酸类物质的色素，在酸性条件下更有利于中性氧化铝对这些色素成分的吸附，使得中性氧化铝的用量和pH值对积雪草提取物的脱色起决定性作用。

图3 不同影响因素交互作用的响应面图Fig.3 Response surface diagram of the interaction of different influencing factors

综上得到积雪草提取物脱色最优条件为：中性氧化铝为1.562 g、脱色时间为25.7 min、脱色温度为50.7℃、pH值为6。

3.2.4 验证试验

将响应面法得到的积雪草提取物脱色最优条件按“2.1”项操作进行验证试验，得到样品的脱色率实测值为81.1%（n=3），与理论值相近，说明该方法具有一定的参考性，且脱色后得到的产品中积雪草总苷含量达到了74.9%，明显高于原料含量，同时积雪草总苷的回收率可达76.4%。

4 讨论

本研究首次采用响应面法优化了中性氧化铝对积雪草提取物的脱色条件，得到的脱色效果显著，发现影响积雪草提取物脱色效果的主要因素及优先顺序为中性氧化铝的用量＞pH值＞脱色温度＞脱色时间，其中中性氧化铝的用量与pH值是极显著因素。实验过程中虽然中性氧化铝的用量越多，积雪草提取物的脱色效果越好，但也发现积雪草总苷的吸附损失量与中性氧化铝的用量呈正比，所以综合脱色效果和目标成分来看，选择8倍量的中性氧化铝用量较为合适。同时进一步发现酸性环境有利于积雪草提取物的脱色，这可能与积雪草提取物中含有的酚酸类物质有关，但溶液酸性不能过强，当pH＜3时脱色后的产品会发生变化并产生新的深颜色物质，结合实际应用考虑选择pH为6左右较为合适。最后通过本研究最优脱色条件的验证试验，证明了该工艺条件稳定可靠，脱色后积雪草提取物品质得到了明显的提升，且在考察积雪草提取物脱色率的同时，建立了一种积雪草总苷的含量测定方法，为积雪草提取物的品质提升和开发利用提供了一定的科学依据和参考。