杨帅 王月 李根 张亮亮 李楠，4 张会存 伊比然恨 汪红兵,,4**

（1.首都医科大学附属北京中医医院消化科，北京 100010；2.拉萨市人民医院，西藏 拉萨 850000；3.北京中医药大学研究生院；4.首都医科大学附属北京中医医院；5.北京中医研究所，北京 100010）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是一种定植于人胃粘膜呈螺旋状的革兰氏阴性菌，由于自身独特结构和黏附素等因素使其得以黏附、定植胃粘膜上皮细胞，使宿主出现炎症反应造成胃黏膜的损伤[1,2]。同时，Hp 扰乱胃上皮细胞的增殖、凋亡和细胞周期，通过抑制或逃避免疫应答的方式存活于机体内[3,4]，显著影响胃内菌群的构成，其相对丰度的变化直接影响胃黏膜DNA 的修复途径[5,6]，是慢性胃炎及炎癌转化发生发展进程中主要原因，被认为是I 型致癌因子。因此，根除Hp，尤其在胃粘膜发生萎缩、肠上皮化生前，可降低胃癌的发生率[7]。

祖国传统医学中有幽门螺杆菌侵袭人体致病之说，是将Hp 视归为“外邪”。Hp 感染的发病大致可分为内外二因：内因多责之脾胃亏虚、七情内伤以及饮食不节；外因多责之毒邪、外感六淫之邪气侵袭。由于古代医家多将其视作外邪致病，因此，并没有具体明晰的病名产生，而是根据其感染的病位将其大致属“胃脘痛”“痞满”“吞酸”之类[8,9]。科学实践证明，传统医药治疗幽门螺杆菌感染具有良好的效能[10,11]。“甘松”“余甘子”均是我国典型的民族用药，尤其在藏医体系中常用于治疗消化系统疾病，具有良好的效能。其中，甘松，中医认为其味甘微辛，性温，入脾胃、心经，有温中散寒，开郁醒脾，健脾开胃，理气止痛的功效，为脾胃病治疗之要药[12,13]，在藏医临床作“榜贝”入药，且用于治疗“热毒证”与“瘟疫症”[14,15]，具有清热、解毒之功效，现代医学研究亦表明其可促进胃肠蠕动，能防治急性胃炎和急性胰腺炎，具有良好的消炎、抑菌作用[16]。余甘子，亦属藏族习用药材，又名余甘、庵摩勒等，中医认为其味甘、酸、涩，性凉，归肺、胃经，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳等功效[17]。在藏医药中，余甘子具有“众药之王”之称，广泛用于治疗胃肠道疾病、肝胆病、血液病等。能抑制急性炎症的发展，保护胃肠黏膜，抗胃肠溃疡，且具有一定的杀菌作用[18,19]。本研究通过网络药理学方法探究藏药“甘松-余甘子”治疗幽门螺杆菌相关胃炎的有效成分和作用机制。

1 方法

1.1 筛选活性化学成分

检索中药系统药理学数据库与分析平台(Tradi‐tional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，活性化学成分筛选条件设置：口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18，筛选获得甘松、余甘子活性化学成分。

1.2 幽门螺杆菌相关胃炎及化合物作用靶点预测与筛选

以“Helicobacter pylori gastritis”为关键词，检索“GeneCards”“OMIM”“DisGeNET”数据库，查询幽门螺杆菌相关胃炎基因靶标；通过Drugbank 数据库检索活性化学成分的靶点，Drugbank 未能查询到靶点的化学成分，使用Swiss Target Prediction 数据库，将靶点相对应的蛋白转变为种属为homo sapiens（智人）的基因预测靶点，将两者作用靶点去重并汇总，导入Uniprot 数据库，获取最终的作用靶点基因。

1.3 “药物-成分-疾病-靶点”网络构建与分析

获得甘松、余甘子有效成分靶点与幽门螺杆菌相关胃炎靶点之后，通过R 语言中“venn”“randomcolor”R 包，取二者交集靶点获取韦恩图，作为甘松-余甘子与幽门螺杆菌相关胃炎共同作用靶点。

1.4 “蛋白质-蛋白质”相互作用网络构建

将甘松-余甘子与幽门螺杆菌相关胃炎共同作用靶点基因通过R语言“ggsci”“tidyverse”“STRINGdb”“tidygraph”等相关R 包进行蛋白质相互作用网络的构建，设定物种为智人，获取共有靶点基因相关的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)网络。将共同交集靶点蛋白通过Cytoscape 3.7.2 软件绘制PPI网络。综合数据的度值，选取前4位的作用靶点作为核心靶点。

1.5 核心靶点基因功能分析

将交集靶点导入利用R 语言“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”“ggnewscale”等相关R包相关功能进行GO分析、KEGG分析。

1.6 分子对接验证

将“1.4”筛选出的关键成分转换为mol 格式，并通过PDB 数据库获取PDB 格式的核心靶标3D 结构；同时，使用PyMol 软件、AutoDockTools 软件作结构修饰及加全氢、计算电荷等处理，保存为pdbqt 文件，完成分子对接验证；保存最低结合能数据，运行Pymol软件完成分子对接图。

2 研究结果

2.1 活性成分筛选结果

通过检索TCMSP数据库，化合物的初步筛选条件满足OB≥30%，并且DL≥0.18。经去重，共收集到活性化学成分15个，其中甘松4个、余甘子11个。DL数值前15的基本信息见表1。

表1 甘松-余甘子有效活性成分

2.2 筛选活性靶点

通过筛选Drugbank 数据库、Swiss Target Predic‐tion 数据库，获得甘松54 个、余甘子271个作用靶点；通过GeneCards、OMIM、DisGeNet在线数据库，以“Helicobacter pylori gastritis”为关键词查询相关靶标，共获得相关靶点531 个，运用R 语言获得16 个“甘松-余甘子、幽门螺杆菌相关胃炎”交集靶点，见图1。

图1 “甘松-余甘子、幽门螺杆菌相关胃炎”交集靶点

2.3 “药物-成分-疾病-靶点”网络

运用Cytoscape 3.7.2软件获取“药物-成分-疾病-靶点”网络，其中包含34 个节点，107 条边，见图2。Degree指与节点相连边的数量。前4位的Degree排名化合物成分为：表没食子儿茶素没食子酸酯(MOL006821，Degree=15)、槲皮素(MOL000098，Degree=13)、金合欢素(MOL001689，Degree=11)、木犀草素(MOL000006，Degree=10)，Degree 值见表2。以上化合物在发挥治疗效用方面可能具有较大的贡献。

图2 “药物-成分-疾病-靶点”网络

表2 Degree值

2.4 PPI网络

将交集共表达靶点通过R 语言构建String 网络，将获得PPI 信息，导入Cytoscape 3.7.2 软件获取PPI 网络，见图3。图中靶点对应节点的大小、颜色的不同表示Betweenness（PPI 次数）值的差异，选取排名前4 位的靶点基因用红色突出显示；分析结果显示共526 条关系线条，Betweenness 值前4 位的靶点基因PTGS2（Betweenness=15.32）、TNF（Betweenness=12.20）、CASP3（Betweenness=9.79）、TP53（Betweenness=9.79），Betweenness值见表3。

表3 Betweenness值

图3 PPI网络

2.5 生物功能富集分析

为进一步阐明甘松、余甘子的作用机制，采用R语言相关R包对交集靶点通过GO功能富集分析，得取生物过程（Biological Process，BP）1349 个，细胞组成（Cell Composition，CC）26 个，分子功能（Molecular Function，MF）69个。按P值排序（P＜0.05）将前20条绘图表示，其中点越大表示富集基因数越多，颜色越红表示药物对疾病的干预越密切，主要涉及细胞器外膜、外部膜、膜筏、膜微域、线粒体外膜、核膜、细胞核膜等细胞成分；神经元死亡调节、神经元死亡、电离辐射响应、糖皮质激素反应、对紫外线的反应、内在的凋亡信号通路、皮质类固醇反应等生物过程；肿瘤坏死因子受体超家族结合、BH 结构域结合、死亡域结合、死亡受体结合、肿瘤坏死因子受体结合、细胞因子受体结合、蛋白酶结合等分子过程，见图4（1）。对关键靶点进行KEGG 通路富集分析，得到73条信号通路，按P值排序(P＜0.05)将前20条绘图表示P53信号通路、AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、坏死性凋亡途径等通路，见图4（2）。通过KEGG-cnet可获知细胞凋亡、乙型肝炎、麻疹、P53信号通路、铂耐药等分子信号途径与疾病核心靶点有着密切的联系，见图4（3）。

图4 生物功能富集分析

2.6 分子对接验证

将“2.4”中筛选得到部分核心靶点（PTGS2、TNF、CASP3、TP53）与“2.3”中筛选获取的部分核心成分进行分子对接。筛选结合能≤-5.0 kJ/mol 的药物分子，我们视作其与靶点存在结合活性，经筛选，核心靶点与有效化学成分的结合能均小于-5.0 kJ/mol，结合能绝对值最大的为PTGS2与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、木犀草素，STAT3 与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯，各分子对接预测结合能见表4，预测结合位点见图5。这也可以证明，甘松、余甘子活性化学成分可对核心靶点可发挥调控作用。

表4 靶点基因与核心化学成分对接预测结合能

图5 靶点基因与核心化学成分分子对接图

3 讨论

藏药甘松、余甘子常用于治疗各种脾胃疾病，二者联合应用，不仅对幽门螺杆菌具有一定抑制作用，而且对于胃粘膜的修复具有一定的促进作用。可显著缓解患者的临床症状，同时，也可以减轻胃黏膜炎症反应。本研究通过网络药理学及分子对接方法探究“甘松”“余甘子”治疗幽门螺杆菌相关胃炎的有效成分和作用机制。

根据“甘松-余甘子”药对-有效成分-共同靶点-幽门螺杆菌相关胃炎网络图，得出Degree 值，按其大小选出4 种核心成分，依次为表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、金合欢素、木犀草素。表没食子儿茶素没食子酸酯化学成分可通过内在途径启动细胞死亡，并抑制癌症EGFR、STAT3、ERK、NF-κB 和Akt介导的信号传导，可作为COX、NO 合酶、TNF 和白细胞介素信号通路的抑制剂，它通过激活p53 和PTEN/p21、发挥抗癌、抗氧化、抗炎、抗血管生成和凋亡作用［20］。槲皮素对胃黏膜上皮细胞有体外抗炎活性，通过抑制TNF-α 诱导的正常人胃上皮细胞基质MMP-9 表达发挥作用，用于保护胃粘膜上皮细胞［21］。同时，槲皮素可作为一种非竞争性脲酶抑制剂，能够耐受广泛的结构修饰［22］，显著降低幽门螺杆菌导致的单核细胞的浸润指数和幽门窦和胃体定植，减少了胃粘膜中的幽门螺杆菌感染炎症反应和脂质过氧化［23］。金合欢素是一种O-甲基化黄酮，通过降低COX-2 和NO 合酶的活性、蛋白质和mRNA 表达以及转录激活来显示抗炎潜力，抑制TLR4、TRAIL-R1、IL-6、TNF-α、IL-5；降低JNK、P38 和ERK 磷酸化以及NF-κB的表达发挥抗微生物、抗炎、抗癌、抗氧化等生物活性。同时，调节肠道微生物，恢复小鼠肠道菌群平衡，抑制肠道炎症［24,25］。木犀草素的主要药理机制是其抗炎活性，这种活性来自其调节各种炎症介质，并改变炎症中转录因子对STAT3/IRF-1、NF-κB 和AP-1 通路的调节［26］。同时，亦有研究证明，木犀草素对胃溃疡患者幽门螺杆菌菌株生长和芳胺乙酰转移酶活性具有抑制作用，木犀草素通过cMet/ Akt/ERK信号在cMet 过度表达的胃癌模型中表现出显著的抗肿瘤作用,上调人胃癌细胞中的miR-34a来降低Bcl-2的表达，从而抑制炎癌转化过程［27］。

幽门螺杆菌相关胃炎具有复杂的发病机制，多种炎症相关分子及途径在幽门螺杆菌相关胃炎中发挥重要作用。PTGS2 也称为环氧化酶2（COX2），是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，其表达与炎性细胞因子和生长因子诱导相关，特别是胃泌素和活性氧［28］。研究证明，幽门螺杆菌相关的急性和慢性炎症与胃上皮细胞中PTGS2 的表达有关，表达程度与慢性炎症细胞浸润的程度密切相关，PTGS2 的慢性表达，不仅导致胃炎持续存在，同时也在幽门螺杆菌相关胃炎癌变进程中起重要作用［29］。TNF-α 是主要的免疫调节因子，能介导细胞凋亡，促进细胞增殖，在炎症、肿瘤等众多生理病理进程中发挥作用［30］。研究证明，TNF-α 能抑制胃酸分泌，促进幽门螺杆菌感染范围扩大，诱导胃炎发生，同时，TNFα 促进胃癌发生、细胞增殖、胃癌侵袭和转移、上皮间质转化、新生血管形成等多个病理过程［31,32］。STAT3 是众多致癌信号通路的汇聚点，在癌症和非癌症细胞中都广泛超活化，并在抑制关键免疫激活调节因子的表达和促进免疫抑制因子的产生中发挥重要作用。研究证明，幽门螺杆菌通过细胞毒素（cagA）激活的酪氨酸磷酸化的STAT3 转导途径，增加趋化因子表达，促进黏膜炎症的发生［33］。同时，在多种肿瘤中均可检测到异常活化，幽门螺杆菌感染时，潜在转录因子STAT3 是许多致癌细胞过程的有效驱动因素，包括细胞增殖、存活和迁移、炎症、血管生成和免疫抑制［34,35］。TP53 亦称P53，是一种人体中重要的肿瘤抑制因子，幽门螺杆菌感染可通过激活PI3K/Akt 通路诱导氧化应激导致DNA 损伤，干扰TP53 表达，进而细胞周期失调、细胞增殖失衡，促进炎癌转变［35,36］。

KEGG 信号通路富集分析显示“甘松-余甘子”的重要靶点主要富集于P53信号通路、HIF-1信号通路、TNF 信号通路等，主要发挥调节机体炎症反应、细胞凋亡、抗癌等生物功能。P53 是与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因，作为转录因子并调节各种细胞功能，基因突变可抑制P53 转录活性，导致肿瘤发生发展［37］。HIF 是低氧调节的关键因子，其激活可参与癌症生物学关键方面的基因的转录。HIF-1α 可以在严重或持续缺氧的情况下诱导细胞凋亡［38,39］。研究发现，胃粘膜微循环障碍、持续缺血和缺氧是胃粘膜损害的重要因素。粘膜持续的缺血和缺氧会诱导HIF-1α 的高表达，HIF-1α 可以直接或间接结合p53 结构域，增加p53 的稳定性，加强p53 促进凋亡的作用［39］。激活的p53 进入细胞核，通过调节Bcl2和Bax 的表达启动凋亡过程［40］，导致胃粘膜持续损害［41］。研究证明，幽门螺杆菌不仅通过稳定HIF-1诱导了延长的M1 极化，而且阻止了向M2 巨噬细胞的转换，后者在炎症中起着关键作用。靶向HIF-1已被证明对慢性炎症有益，髓样HIF-1 对幽门螺杆菌介导相关胃炎具有保护性抑制作用［42］。TNF-α相关信号通路参与多种炎症与癌症发生［32］，研究证明，幽门螺杆菌诱导TNF-α 在炎症和癌症的发展中起着关键作用，加强了Tip-α 作为一种致癌因子的作用，不同于幽门螺杆菌产生的CagA 和VacA，Tipα 通过与受体细胞结合，诱导促炎细胞因子和EMT，对促炎细胞因子的转录激活以及胃炎、胃腺癌的发展有重要作用［43］。

本研究通过网络药理学方法和分子对接技术，筛选出藏药“甘松-余甘子”治疗幽门螺杆菌相关胃炎的活性化学成分、关键作用靶点以及潜在作用机制，“甘松-余甘子”可通过多种化学组分及途径改善幽门螺杆菌相关胃炎、保护胃粘膜，抑制炎癌转化的进程，其中PTGS2、TNF、STAT3 和TP53 等靶点可能为“甘松-余甘子”发挥作用的关键靶点，而P53 信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等可能是“甘松-余甘子”发挥抗炎、抗癌、抗氧化、抗凋亡、促进血管生成的关键信号通路。本研究为“甘松-余甘子”用于治疗幽门螺杆菌相关胃炎提供药效物质基础和作用机制参考。