程静，卢立，关鑫磊，吴涛，刘立，任朝阳，宋红萍

(1.武汉市第四医院药学部，武汉 430033； 2.武汉市东西湖区医保局，武汉 430041)

慢性难愈性创面，如糖尿病足、压疮、放射性溃疡、静脉淤滞性溃疡等是临床常见的疾病，病程长，病情迁延难愈，严重影响患者的生活质量，成为临床上急需解决的难点。武汉市第四医院制剂室研发的复方硝酸甘油凝胶剂，前期实验显示其具有调节溃疡创面新生毛细血管数量、促进创面愈合的作用[1]。本实验探索复方硝酸甘油凝胶剂对激素诱导的慢性难愈性创面的作用。现阶段慢性难愈性创面尤其是高糖环境所致的慢性难愈性创面的患者不断增多，本实验考察复方硝酸甘油凝胶剂对高糖诱导人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 损伤的作用，为后续研究其对糖尿病性慢性难愈性创面的作用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 HUVECs细胞株由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。取含10%胎牛血清(FBS)、1%双抗的F12K培养基置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱中传代培养。每隔1 d换液，取对数生长期的细胞用于实验。

1.1.2实验动物 无特定病原体(SPF)级，SD雄性大鼠30只，体质量220～250 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2021-0009。动物自由进食饮水，12 h明暗交替光照，环境温度23～27 ℃，相对湿度45%～75%。所有实验操作遵循国际卫生研究机构关于动物使用伦理学方面的原则。

1.1.3主要试剂和仪器 复方硝酸甘油凝胶剂(制剂室在研，处方由硝酸甘油5%，醋酸氯己定0.3%等组成，批号：20200429)。京万红(批号：211509)，购于天津达仁堂达二药业有限公司；0.1 g注射用氢化可的松琥珀酸钠(批号：202107041)，购于烟台东诚北方制药有限公司；白细胞介素(IL)-1、IL-10试剂盒(批号：20211104，20211027)，购于南京建成生物工程研究所；DMEM/F12培养液(货号：SH30023)，购于武汉普诺赛生命科技有限公司；Transwell小室，购于美国Corning公司；胎牛血清(货号：141215)，购于杭州天杭生物科技有限公司；胰酶-EDTA(货号：GNM25200)、磷酸盐缓冲液(PBS，货号：GNM20012)，购于吉诺生物医药技术有限公司；CCK-8检测试剂盒(货号：C0038)，购于碧云天生物技术有限公司；结晶紫染液(货号：AS1086)，购于武汉阿斯本生物技术有限公司；CO2恒温培养箱(SCO6WE)由SHEL LAB提供；洁净工作台(SW-CJ-1FD)由苏净安泰提供；酶标检测仪(DR-200Bs)由Diatek提供。病理组织包埋冷冻台(BMJ-A型)由中国常州市中威电子仪器有限公司提供；自动组织脱水机，VP1～JC，由日本樱花公司提供；石蜡切片机(LEICA RM2235)由德国提供；倒置显微镜(IX51)由日本OLYMPUS公司提供。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，美国Media Cybernetics公司提供。

1.2方法

1.2.1对高糖诱导HUVECs细胞损伤模型细胞活力的影响 前期已通过CCK-8法检测复方硝酸甘油对HUVECs细胞存活率的试验，选取细胞存活率在80%以上且对细胞活力无显著性影响的浓度作为后续实验的给药浓度[2]。将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为每毫升悬液1×105个细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2(5%)培养箱中37 ℃下培养24 h。细胞分组，分为正常对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol·L-1)，模型对照组(葡萄糖浓度为33 mmol·L-1)，实验组(分别加入终浓度为0.01，0.1，1 mmol·L-1的复方硝酸甘油凝胶剂，葡萄糖浓度为33 mmol·L-1)，每组6个复孔。给药后72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培养箱中孵育2 h，使用酶标仪测定波长450 nm处吸光度(A值)。以溶剂处理的细胞为对照组，按公式计算复方硝酸甘油凝胶剂对细胞的相对存活率，细胞存活率(%)=(实验组A值/模型对照组A值)×100%。

1.2.2对高糖诱导HUVECs细胞损伤模型Transwell迁移能力的影响[3]取对数期生长的HUVECs细胞，将细胞制成每毫升悬液1×105个细胞，取细胞悬液1 mL于1500 r·min-1离心5 min，弃上清液。加入无血清培养基1 mL，吹打均匀后取细胞悬液200 μL放入transwell小室中，上室各接种上正常对照组的HUVECs细胞及经高糖诱导细胞损伤的HUVECs细胞，下室加入含不同浓度复方硝酸甘油凝胶剂的条件培养基(同“1.2.1”)。24孔板中加入含10% FBS的完全培养基500 μL，将小室放入板中，在37 ℃细胞培养箱培养72 h。将小室取出，用PBS洗去培养基，用棉签将上室中的胶和细胞擦除干净，多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，结晶紫染色10 min，洗去表面的结晶紫，于倒置显微镜下对非细胞接种侧摄相同时对附着在小室膜下室侧经结晶紫染色后摄相(显微镜放大倍数×100)，Image J软件分析各组细胞的迁移细胞计数，随机计数6个视野，取平均值，每组重复3次。

1.2.3对高糖诱导HUVECs细胞损伤模型划痕实验的影响[4]先用Marker笔在6孔板背后均匀画平行的直线，0.5～1 cm一道，横穿过孔，每孔5条。取对数期生长的HUVECs细胞，调整细胞悬液浓度使铺板细胞密度为5×105个·mL-1，将细胞接种到6孔板中，每孔加入细胞悬液2 mL，培养孵育72 h。待细胞单层在6孔板底部铺满时，用200 μL无菌枪头垂直于Marker笔的横线划痕，PBS清洗3次，按照上面分组加入不同药物和培养基(同“1.2.2”)，置于5%CO2培养箱中37 ℃下培养24 h。倒置光学显微镜下观察并摄相，使用IPP软件测量0 h以及24 h的细胞划痕面积(间隙宽度)的平均长度来确定迁移程度，计算公式：划痕愈合百分比(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.4对激素诱导的慢性难愈性创面修复作用实验研究[5-6]雄性SD大鼠适应性饲养1周后用于溃疡模型的建立，用10%水合氯醛0.4 g·kg-1腹腔内麻醉后背部剃毛，用直径为2 cm的打孔器在背部正中打孔，深度达到筋膜层，2 h后创面局部多处肌内注射0.8%氢化可的松(给药剂量80 mg·kg-1)，制成难愈性创面模型。然后按体质量采用随机数字表法随机分为3组，每组10只，动物皮肤给药按照每平方厘米计算，分别为复方硝酸甘油凝胶剂组(0.98 g·kg-1)、阳性组(京万红)(0.79 g·kg-1)、模型对照组(等量空白凝胶基质)。各组于造模次日开始涂药。各组分别在造模后第14天取创面中心肉芽组织马松(Masson)染色，用Image-Pro plus(IPP)6图像分析软件测定创面胶原蛋白面积与视野内创面的总面积，两者比值的百分比即为胶原蛋白含量，记录并计算平均值。采用ELISA法测定血清IL-1、IL-6水平。

2 结果

2.1对高糖诱导HUVECs细胞损伤模型细胞活力的影响 预实验确定使用含33 mmol·L-1葡萄糖的高糖培养基诱导细胞损伤72 h作为细胞损伤模型。本实验结果显示，与正常对照组比较，高糖环境对HUVECs细胞增殖能力明显减弱，细胞相对存活率降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，随着药物浓度的增加，0.1，1 mmol·L-1复方硝酸甘油凝胶剂对HUVECs细胞增殖能力明显增加，细胞相对存活率提高，呈现浓度依赖性(均P<0.01)，说明复方硝酸甘油凝胶剂能在一定程度上提高高糖诱导的HUVECs细胞损伤模型的细胞活力，对高糖诱导的HUVECs细胞损伤模型具有保护作用。见图1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.小剂量组；D.中剂量组；E.大剂量组。①与正常对照组比较，t=15.699，P<0.01；②与模型对照组比较，t=6.343，11.255，P<0.01。图1 高糖诱导HUVECs细胞损伤模型细胞活力 A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=15.699， P<0.01；② Compared with model control group，t=6.343，11.255， P<0.01.Fig.1 Effect of compound nitroglycerin gels on cell viability of high glucose-induced HUVECs injury model

2.2对高糖诱导HUVECs细胞损伤模型Transwell迁移能力的影响 正常对照组、模型对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组每视野穿过Transwell小室的细胞数分别为132.80±5.22，40.20±5.93，49.60±5.03，69.40±5.41，102.00±5.70。与正常对照组相比，模型对照组迁移细胞数明显减少(P<0.05)；与模型对照组相比，复方硝酸甘油凝胶剂处理后各组均能够增加高糖诱导的HUVECs细胞损伤模型向Transwell下室迁移的能力，其中0.01，0.1，1 mmol·L-1复方硝酸甘油凝胶剂迁移数目明显增加，呈现浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图2。

A.正常对照组；B. 模型对照组；C.小剂量组；D.中剂量组；E.大剂量组。①与正常对照组比较，t=28.714，P<0.01；②与模型对照组比较，t=2.960，P<0.05；③与模型对照组比较，t=8.906，18.398，P<0.01。图2 高糖诱导HUVECs细胞损伤模型Transwell迁移能力(×100) A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=28.714，P<0.01；②Compared with model control group，t=2.960，P<0.05；③Compared with model control group，t=8.906，18.398， P<0.01.Fig.2 Effect of Compound nitroglycerin gels on migration of glucose-induced HUVECs injury model(×100)

2.3对高糖诱导HUVECs细胞损伤模型划痕实验的影响 正常对照组、模型对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组24 h划痕愈合比分别为(75.91±0.89)%，(20.23±2.60)%，(25.86±2.53)%，(45.83±1.62)%，(58.33±1.44)%。与正常对照组比较，模型对照组细胞迁移能力明显减弱，划痕愈合百分比明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组相比，复方硝酸甘油凝胶剂处理后各组无细胞宽度明显缩小，其中0.01，0.1，1 mmol·L-1复方硝酸甘油凝胶剂能明显促进划痕愈合，呈现浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，提示复方硝酸甘油凝胶剂能够促进高糖诱导的HUVECs细胞损伤模型的划痕愈合。见图3。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.小剂量组；D.中剂量组；E.大剂量组。①与正常对照组比较，t= 49.630，P<0.01；②与模型对照组比较，t=3.801，20.470，31.400，P<0.01。图3 高糖诱导HUVECs细胞损伤模型划痕愈合能力(×40) A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=49.630，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.801，20.470，31.400，P<0.01.Fig.3 Effect of Compound nitroglycerin gels on the ability of scratch wound-healing(×40)

2.4对激素诱导的慢性难愈性创面修复作用实验研究 与模型对照组比较，给药后第14天复方硝酸甘油凝胶剂组胶原蛋白含量比明显增加，IL-1、IL-6含量降低(P<0.05)。与京万红组比较，复方硝酸甘油凝胶剂组胶原蛋白含量比有增加趋势，IL-1、IL-6含量有降低趋势(P>0.05)，见表1。本研究中采用Masson染色观察创面愈合早期胶原沉积，染色后胶原纤维呈蓝色。模型对照组胶原纤维束稀疏，排列紊乱；京万红组胶原纤维较粗，排列较规则；复方硝酸甘油凝胶剂组成纤维排列较整齐致密，较粗大，排列有序。见图4。

表1 复方硝酸甘油凝胶剂对胶原蛋白含量比的影响 Tab.1 Effects of compound nitroglycerin gels on the content of collagen in skin ulcer rats

A.模型对照组；B.京万红组；C.复方硝酸甘油凝胶剂组。图4 复方硝酸甘油凝胶剂对创面胶原纤维生成的影响(Masson，×40) A.model control group；B.Jinwanhong group；C.Compound nitroglycerin gels group.Fig.4 Effect of compound nitroglycerin gels on the formation of collagen fiber in the wound(Masson，×40)

3 讨论

血管新生受损、局部供血不足是导致慢性难愈性创面的主要原因之一[3]。新生血管内皮细胞的增殖和迁移是促进创面愈合的关键步骤。创面早期成纤维细胞可直接与炎症细胞相互作用，参与控制创面炎症反应[7]。早期病原体入侵促使吞噬细胞与自然杀伤细胞活化，产生细胞因子，使更多的抗体、补体和免疫细胞集中于炎症部位，诱导获得性免疫，是机体抵御外来感染和创伤等的保护反应[8]。其中IL-1、IL-6与创面的急性炎症反应密切相关，对机体组织的影响更为重要[9]。炎症期，创面组织中的巨噬细胞促进成纤维细胞的增殖和分化，成纤维细胞能够分泌多种生长因子，如一氧化氮(NO)，增强胶原合成并促进愈合[10]。

硝酸甘油属于硝酸酯类药物，临床上主要用于心绞痛、急性心肌梗死、充血性心力衰竭等。硝酸甘油进入机体后转化为NO发挥作用。SCHAFFER等[11]发现NO能促进创面血管生成及内皮细胞、角质细胞等迁移和增殖，参与创面愈合的过程。高糖环境所致的慢性难愈性创面的不断增多，本研究探讨复方硝酸甘油凝胶剂对慢性难愈性创面的作用。细胞活力结果显示，与对照组比较，高糖环境能明显抑制HUVECs细胞增殖，使细胞相对存活率降低，说明高糖诱导HUVECs细胞损伤。复方硝酸甘油凝胶剂能促进高糖环境下HUVECs细胞的增殖，提高细胞活力，对高糖诱导的HUVECs细胞损伤模型具有保护作用；迁移实验结果显示，与对照组相比，高糖环境下HUVECs细胞向Transwell下室迁移细胞数明显减少，迁移能力明显减弱，划痕愈合百分比明显减少，但经复方硝酸甘油凝胶剂干预后HUVECs细胞向Transwell下室迁移数增加，划痕愈合百分比明显增加，且随着浓度的增加，其促迁移能力、愈合能力也增加，从而有利于血管新生，促进创面愈合。本研究中体内实验显示复方硝酸甘油凝胶剂能明显降低激素诱导的慢性难愈性大鼠14天后创面IL-1、IL-6的含量，降低创面早期的炎症反应，本研究与刘丽平等[12]研究相互印证，这可能与硝酸甘油在体内转化成NO使血管平滑肌松弛，减少白细胞和血小板黏附，减轻组织水肿，改善微循环，从而减少炎症因子释放有关。复方硝酸甘油凝胶剂能增加给药14天后胶原蛋白含量比，促进成纤维细胞增殖和胶原纤维沉积，增加肉芽组织形成，促进溃疡创面的愈合。

综上所述，在以高糖诱导的HUVEs细胞损伤模型及激素诱导的慢性难愈性创面大鼠模型为载体基础上，发现复方硝酸甘油凝胶剂作为NO供体的硝酸甘油在一定范围内增加内皮细胞增殖的作用，促进内皮细胞的迁移，具有较好的促血管生成和促创面愈合活性；调控创面的炎症细胞和成纤维细胞相互作用，降低创面的炎症反应，炎症细胞能够促进成纤维细胞的增殖和分化，促进胶原蛋白的合成，进而促进创面愈合。