黄凤蕊，黄淡霞，黄楚燕

(广州中医药大学第一附属医院药学部，广东 广州 510405)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion，MIRI)指冠状动脉缺血缺氧一定时间后恢复正常血流灌注时，缺血心肌组织损伤进行性加重的过程，临床多见于冠状动脉搭桥术、溶栓术等术后的血管再通过程[1]。既往研究[2-3]认为，MIRI是由于再灌注过程中，氧自由基的大量合成、炎性因子的大量释放、钙离子超负荷等引起的心功能障碍和心肌损伤，可影响患者心肌缺血后心功能的恢复。艾塞那肽是一种人工合成的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)类似物，其生物学效应与GLP-1类似，临床常用于降血糖，保护心血管[4]。已有研究[5-6]显示，艾塞那肽可降低MIRI大鼠的氧化应激水平，减轻MIRI损伤，改善心功能。再灌注过程中产生的大量氧自由基可以激活线粒体凋亡途径，诱导心肌组织细胞凋亡[7]。本研究拟探讨艾塞那肽对MIRI大鼠线粒体凋亡途径的影响，以分析其保护心肌组织的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂与仪器

艾塞那肽注射液购自美国Baxter Pharmaceutical Solutions LLC；TUNEL组织细胞凋亡检测试剂盒购自中国艾美捷科技有限公司；肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-MB，CK-MB)、肌红蛋白(myoglobin，Mb)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒均购自南京森贝伽生物科技有限公司；组织线粒体分离试剂盒购自上海经科化学科技有限公司；兔抗鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因、Bcl相关蛋白(Bcl-assaciated X protein，Bax)、细胞色素C(cytochrome C，Cyt-c)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗均购于美国CST公司；光学显微镜(BX60型)，由日本OLYMPUS公司提供。

1.2 实验动物

SD大鼠36只，SPF级，均为雄性，体重260～280 g，由广州中医药大学第一附属医院实验动物中心提供[许可证号SCXK(粤)2018-0034]，饲养于广州中医药大学第一附属医院实验动物中心实验室[许可证号SYXK(粤)2018-0001]。

1.3 动物造模和药物干预

36只SD大鼠预饲养7 d后，采用随机数表法分为假手术组(n=12)、MIRI组(n=12)、艾塞那肽组(n=12)。除假手术组外，所有大鼠均参考已有文献制备MIRI模型[8]，方法：常规麻醉，依次剪毛、消毒皮肤、打开胸腔，暴露心脏，找到左冠状静脉主干，在距根部2 mm左右处，采用线栓结扎MIRI组和艾塞那肽组大鼠的冠状动脉左前降支，30 min后松开线栓，恢复局部组织血流灌注，恢复灌注120 min后，采集组织标本，用于后续实验。若线栓结扎后，心肌组织出现颜色变化，且心电图显示大鼠的ST段抬高则为造模成功。假手术组大鼠只插入线栓，不结扎冠状动脉。缺血前1 h，艾塞那肽组大鼠皮下注射10 μg/kg艾塞那肽(溶于生理盐水)进行预处理。假手术组和MIRI组皮下注射等体积生理盐水。

1.4 标本采集及心肌梗死面积检测

再灌注120 min后，采集各组大鼠的颈动脉血液2 mL，设置转速为3 000 rpm，离心10 min，分离上清，暂存于-20 ℃冰箱保存。再次结扎冠状动脉前降支，经颈静脉注入1%伊文斯蓝溶液2 mL，待大鼠口唇及肢体变蓝，分离左心室组织，切片，进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色，缺血区为红色，梗死区为白色，正常心肌为蓝色，经Image-pro Plus软件分析各组梗死面积。分离心脏组织，一部分暂存于-80 ℃冰箱保存，用于检测组织中蛋白表达，另一部分置于甲醛中固定，用于检测心肌组织损伤。

1.5 HE染色和TUNEL染色检测各组大鼠心肌组织损伤

取甲醛固定的心肌组织，常规制作切片，一份切片采用TUNEL染色，依次进行脱蜡至水、蛋白酶K细胞通透、多聚甲醛固定、封闭，加入100 μL TUNEL反应混合液在37 ℃暗湿盒中反应1 h，终止反应后使用0.3%的H2O2封闭5 min，100 μL Streptavidin-HRP工作液反应30 min，依次显色、脱水、透明和封片，光学显微镜观察细胞凋亡情况，每张切片随机取5个视野拍照，计算每个视野下细胞总数及阳性细胞数，并计算出比值，则视为细胞凋亡率。另一份切片经HE染色后，在光学显微镜观察三组大鼠组织的病理变化。

1.6 血清CK-MB、Mb、cTnI的测定

取大鼠血清，采用ELISA法检测血清CK-MB和Mb水平，间接竞争ELISA法检测血清cTnI水平，严格按照试剂盒说明操作。

1.7 心肌组织中相关因子的测定

将冻存的心肌组织取出后，匀浆，取上清，采用试剂盒检测心肌组织SOD水平，比色法检GSH-px水平，硫代巴比妥酸法检测MDA水平，严格按照试剂盒说明操作。

1.8 Western blot检测心肌组织Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cyt-c表达情况

将冻存的心肌组织分成两份，一份匀浆后，直接提取总蛋白，经电泳、转膜、封闭，加一抗(Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3，稀释比例均为1∶500)，4 ℃孵育过夜，加二抗，室温孵育2 h，显影，β-actin为内参，凝胶成像系统分析各蛋白条带，计算各组蛋白相对β-actin的表达量。另一份采用试剂盒提取线粒体和胞质蛋白，向心肌组织中加入1 mL胞质提取Buffer，冰上均质30～50次，涡旋，离心(4 ℃，3 000 rpm，10 min)，取上清，离心(12 000 rpm，30 min)，将上清再次离心(4 ℃，3 000 rpm，10 min)，取上清为胞质蛋白，向沉淀中加入1 mL胞质提取Buffer，依次进行涡旋，离心，取沉淀为线粒体，以β-actin为内参，检测线粒体和胞浆中Cyt-c蛋白相对β-actin的表达量。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 艾塞那肽对MIRI大鼠心肌组织病理变化的影响

HE染色后经光学显微镜观察可见，假手术组大鼠的心肌组织细胞结构完整，排列整齐，未见明显异常；MIRI组显示心肌纤维断裂，大量细胞出现变性、坏死，且伴随大量炎性细胞浸润；与MIRI组比较，艾塞那肽组显示心肌纤维断裂减少，部分细胞出现了变性、坏死，病变明显减轻。见图1。艾塞那肽组大鼠的心肌梗死面积低于MIRI组[(34.72±5.63)%vs.(51.22±8.40)%，P<0.05]。

2.2 艾塞那肽对MIRI大鼠血清心肌损伤标志物的影响

艾塞那肽组的血清CK-MB、Mb和cTnI水平低于MIRI组(P<0.05)；MIRI组血清CK-MB、Mb和cTnI水平高于假手术组(P<0.05)。见表1。

表1 血清心肌损伤标志物水平

2.3 艾塞那肽对MIRI大鼠心肌组织MDA、SOD和GSH-px水平的影响

艾塞那肽组心肌组织MDA水平低于MIRI组，SOD和GSH-px水平高于MIRI组(P<0.05)；MIRI组各指标水平变化均大于假手术组(P<0.05)。见表2。

表2 心肌组织MDA、SOD和GSH-px水平

2.4 艾塞那肽对MIRI大鼠心肌组织细胞凋亡的影响

艾塞那肽组心肌组织细胞凋亡率低于MIRI组[(18.25±4.10)%vs.(27.83±5.26)%，P<0.05]，MIRI组心肌组织细胞凋亡率高于假手术组[(27.83±5.26)%vs.(7.82±1.55)%，P<0.05]。见图2。

2.5 艾塞那肽对MIRI大鼠心肌组织Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cyt-c表达的影响

艾塞那肽组心肌组织Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和胞浆Cyt-c表达水平低于MIRI组，线粒体Cyt-c表达高于MIRI组(P<0.05)；MIRI组心肌组织Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和胞浆Cyt-c表达水平均高于假手术组，线粒体Cyt-c表达水平低于假手术组(P<0.05)。见图3及表3。

表3 心肌组织Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cyt-c表达

3 讨论

MIRI是缺血组织恢复血流供应时损伤加重的现象，与缺血时间、侧支循环、需氧程度等多种因素有关，可导致严重的心律失常，甚至猝死，临床尚缺乏治疗的特效药物[9]。GLP-1受体广泛分布于大鼠和人类的血管内皮、冠状动脉、心肌细胞中，GLP-1可与相应受体结合，发挥心肌保护作用，增强胰岛素敏感性[10]。艾塞那肽是GLP-1同源物，与GLP-1具有相似的作用，且稳定性好，可以促进心肌细胞的能量代谢，减轻心肌组织的缺血缺氧损伤，改善心功能[11]。本研究发现，艾塞那肽可降低MIRI大鼠的心肌梗死面积，减轻心肌组织损伤，说明艾塞那肽可以保护MIRI大鼠心肌组织免于损伤。本研究结果还显示，相比于假手术组，MIRI大鼠血清中CK-MB、Mb和cTnI水平升高，经艾塞那肽作用后，其水平降低。CK-MB、Mb和cTnI均在心肌组织内分布广泛，在心肌细胞受到损伤时，可以释放进入血液循环，引起血清中水平升高，是临床常用的反映心肌组织损伤的标志蛋白[12]。艾塞那肽可能通过改善心肌细胞的能量代谢，减轻MIRI大鼠的心肌细胞损伤，降低血清中心肌损伤标志物水平。王东娟等[13]研究发现，GLP-1可以调节机体的氧化应激信号通路，减轻心肌组织的氧化应激损伤，说明艾塞那肽可能也通过调节MIRI大鼠的氧化应激水平，保护心肌组织，其具体机制尚需进一步研究。

本研究中，相比于假手术组，MIRI大鼠心肌组织中MDA水平显著升高，SOD和GSH-px显著降低，经艾塞那肽作用后，MDA显著降低其水平，SOD和GSH-px水平显著升高。SOD和GSH-px是机体主要的抗氧化酶，可与体内过多的过氧化物作用，并通过氧化还原反应将其转化为其它物质，抑制氧自由基产生，降低细胞内的氧化应激水平[14]。MDA是细胞内氧自由基代谢过程中生成的中间产物，可以反映机体的氧化应激水平[15]。机体氧化/抗氧化系统失衡产生的大量氧自由基可以破坏线粒体膜结构，影响心肌细胞能量代谢障碍，激活线粒体凋亡途径，诱导心肌组织细胞死亡，导致MIRI损伤[16-17]。表明艾塞那肽可能通过维持氧化/抗氧化平衡，改善心肌细胞能量代谢，减轻MIRI大鼠心肌组织氧化应激损伤。

本研究发现，相较于假手术组，MIRI大鼠的Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表达升高，胞浆Cyt-c升高，线粒体Cyt-c下降，心肌细胞凋亡率升高，经艾塞那肽干预后，Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表达下降，细胞凋亡率下降，表明艾塞那肽可以抑制凋亡蛋白表达，抑制MIRI大鼠的细胞凋亡。Bcl-2/Bax是1组重要的细胞凋亡调节蛋白，通过调节细胞线粒体膜的通透性，介导多种细胞凋亡。正常情况下，Bcl-2位于线粒体膜表面，在凋亡信号刺激下，细胞核的Bax会转移至线粒体膜表面与Bcl-2相结合，引起线粒体膜结构变化，继发通透性改变，线粒体Cyt-c释放入胞浆，激活细胞凋亡信号通路[18]。线粒体Cyt-c释放入细胞浆后，与相应的凋亡蛋白酶激活因子结合，激活Caspase凋亡级联反应，启动细胞凋亡程序[19]。Cleaved Caspase-3是调控细胞凋亡的关键蛋白，可进入细胞核，裂解相应的多种胞质胞核底物，最终导致细胞死亡[20]。本研究表明，艾塞那肽可能通过抑制线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达，抑制线粒体Cyt-c释放，抑制心肌细胞凋亡。Yu等[21]研究显示，MIRI大鼠再灌注过程中大量生成的氧自由基可以激活线体体凋亡途径，诱导心肌组织细胞损伤，本研究结果与其相似，即艾塞那肽可能通过降低MIRI大鼠氧化应激水平，抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌组织损伤。

综上，艾塞那肽可降低MIRI大鼠的氧化应激水平，抑制心肌组织细胞凋亡，减轻心肌组织损伤。但本研究尚处于基础研究阶段，仍需大量的临床前研究以进一步验证。