孙明雪，张玉霞，丛百明，夏全超，田永雷，张庆昕，张冬梅

(1 内蒙古民族大学 农学院/内蒙古自治区饲用作物工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028041；2 通辽市农牧科学研究所，内蒙古 通辽 028000；3 内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010010)

紫花苜蓿(MedicagosativaL)作为世界上栽培最为广泛的豆科牧草，具有营养价值高、适口性好等特点[1]。受温带大陆性季风气候的影响，我国内蒙古地区降水主要集中在夏季，冬季寒冷少雪，极易发生倒春寒[2]。内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗为我国紫花苜蓿生产机械化、规模化、集约化程度最高的地区，被誉为“中国草都”[3]，但在2012-2020年，阿鲁科尔沁旗优质紫花苜蓿生产基地多次出现返青率低的问题[4]。

水分是植物生长过程中必要的环境条件和限制因子，更是植物生命过程中的基础物质，植物体内各种生理生化反应、有机物的代谢均有水分参与[5]。干旱胁迫会导致植物活性氧代谢失衡，进而导致膜脂氧化，此时植物体内的一系列抗氧化系统会通过清除活性氧保护细胞结构[6-7]。磷作为植物生命过程中必要的三大元素之一，其在土壤中的移动性较差，且极易被土壤固定，大量施用会导致土壤板结和污染[8]，无法被植物大量吸收，所以磷素目前已被视为限制植物生长及牧草产量的重要因素[9]。水肥组合是指将施肥和灌水融为一体以达到作物高品质高产的农业技术[10]，有研究表明，磷素可显著改善土壤干旱条件下植株的水分状况，增强膜的稳定性，维持植株正常的生命活动，且能够在一定程度上弥补因水分不足造成的影响[11]；有关水磷互作对小麦叶影响的研究表明，干旱条件下，施用磷肥可明显增强叶片过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低了丙二醛(MDA)含量，从而延缓由于干旱造成的细胞衰老[12]。研究表明，高磷与轻度水分胁迫组合能有效地诱导冬小麦从形态与生理代谢两方面作出响应，通过增强根系生长适合度及抗氧化酶活性，使水分的利用率提高，进而增强抗旱能力[13]；也有研究表明，适量的灌水能提高苗期玉米对磷肥的吸收利用效率，说明适当的水磷组合配比可以达到水磷协同效应[14]。目前，关于水磷组合对其他作物生长及生理特性方面的研究很多，但关于其对紫花苜蓿抗寒生理特性影响的研究甚少。为此，本研究在科尔沁沙地分析了不同水磷组合处理下紫花苜蓿根颈的生理指标(CAT、POD、SOD活性和MDA、可溶性蛋白(SP)含量)及越冬率，以期为该地区紫花苜蓿生产中水磷的科学管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗岩峰农业公司(北纬43°21′，东经119°02′)，属于温带大陆性气候，四季分明，降水集中。年平均气温3 ℃，10 ℃以上积温3 000 ℃，无霜期150 d，年平均降水量400 mm，蒸发量是降水量的4～5倍，年平均风速3.7 m/s。土壤有机质含量63.4 mg/kg，碱解氮含量34.89 mg/kg，全氮含量36.02 mg/kg，速效磷含量3.71 mg/kg，速效钾含量77.98 mg/kg。

1.2 试验材料

供试紫花苜蓿品种为‘骑士T’(‘Knights T’)和‘公农1号’(‘Gongnong No.1’)，由北京正道有限公司提供。

1.3 试验方法

于2017年7月1日播种，播种量为22.5 kg/hm2，播种前一次性施入KCl(K2O含量为60%)150 kg/hm2作为基肥。试验设置土壤水分和施磷量2个试验因子，采用两因素裂区试验设计。以水分处理为主区，设置灌水时间间隔分别为4 d(W1)、8 d(W2)和12 d(W3)，每次灌溉到水分入渗至距土壤表面30 cm处(挖开土层目测)，灌水处理时间从播种后第3天(2017年7月4日)至取样前(2017年11月14日)，灌水方式为指针式喷灌。以磷肥施用量(以P2O5计)水平为副区，设置50 kg/hm2(P1)、100 kg/hm2(P2)、150 kg/hm2(P3)3个水平，并设置不施磷肥为对照(CK)，供试肥料为过磷酸钙(P2O5含量为44%)。2个因素共组合成12个处理，每个处理3次重复，共36个小区，3个主区间隔15 m；副区小区试验面积20 m2(4 m×5 m)，小区间隔为1 m。试验期间其他田间管理按常规方法进行。

1.4 样品采集

11月15日前后(封冻前期)，每个处理挖取供试材料50株，带回室内洗净，切取根颈部分测定相关生理指标。取样后的试验田参照孙洪仁等[3]的灌水方法进行田间冬季灌水管理，翌年测定紫花苜蓿越冬率。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 根颈生理指标 MDA含量采用硫代巴比妥酸法[15]测定，POD活性采用愈创木酚法[15]测定，SOD活性采用氮蓝四唑法[15]测定，CAT活性采用紫外吸收法[15]测定，SP含量采用考马斯亮蓝比色法[15]测定。

1.5.2 越冬率(winter survival rate,WSR) 于播种当年2017年10月26日，每小区随机设1个1 m2样方，统计越冬前植株数。2018年3月26日出苗至2018年4月1日返青全部出苗后(5 d内无新增出苗)，统计样方内返青植株数，计算越冬率。越冬率=返青植株数/越冬前植株数×100%[16]。

1.6 数据分析

试验数据用Microsoft Excel 软件处理并制作表格，用DPS 7.0软件进行方差显著性分析及相关性分析，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 水磷组合对紫花苜蓿根颈MDA含量的影响

如表1所示，不同磷肥施用量处理下，随着灌水时间间隔的延长，‘骑士T’和‘公农1号’的根颈MDA含量逐渐增加，在W3处理下达到最大值。在不同的灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’根颈的MDA含量在各施磷处理下均显著低于CK(P<0.05)，其中P2处理对‘骑士T’和‘公农1号’根颈MDA含量的降低效果最显著，该处理‘骑士T’的根颈MDA含量在W1、W2、W3处理下较CK分别降低了54.03%，51.84%和53.62%，‘公农1号’的根颈MDA含量较CK分别降低了51.52%，51.18%和49.72%。结果表明，施用磷肥能降低不同灌水时间间隔处理下紫花苜蓿根颈的MDA含量，且在P2O5施用量为100 kg/hm2(P2处理)时MDA含量最低。

表1 水磷组合对不同品种紫花苜蓿根颈MDA含量的影响

2.2 水磷组合对紫花苜蓿根颈CAT活性的影响

如表2所示，不同磷肥施用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’苜蓿根颈CAT活性均以W2处理显著高于W1处理(P<0.05)，其中‘骑士T’ CAT活性在P1、P2和P3处理下较W1处理分别提高了25.17%，17.91%和15.38%，‘公农1号’较W1处理分别提高了30.95%，32.86%和37.18%。在不同的灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’根颈CAT活性在不同磷肥用量处理下均高于CK，其中以P2磷肥用量处理最高，均显著高于CK(P<0.05)，其中‘骑士T’CAT活性在W1、W2、W3处理下较CK分别提高了57.43%，45.12%和34.75%，‘公农1号’较CK分别提高了43.97%，83.56%和83.53%。结果表明，施用磷肥能显著增强不同灌水时间间隔处理下紫花苜蓿根颈的CAT活性，且在P2O5施用量为100 kg/hm2时CAT活性最强。

表2 水磷组合对不同品种紫花苜蓿根颈CAT活性的影响

2.3 水磷组合对紫花苜蓿根颈POD活性的影响

如表3所示，不同磷肥施用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’的根颈POD活性均在W2处理下最高，说明灌水时间间隔为8 d时POD活性最强。在不同的灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’的根颈POD活性在不同磷肥用量处理下均显著高于CK(P<0.05)，其中以P2磷肥用量处理最高，该处理‘骑士T’在W1、W2、W3处理下的POD活性较CK分别提高了34.59%，58.11%和38.19%，‘公农1号’较CK分别提高了14.60%，59.65%和9.91%。以上结果说明,施用磷肥能提高不同灌水时间间隔处理下紫花苜蓿根颈的POD活性，且在P2O5施用量为100 kg/hm2时POD活性最强。

表3 水磷组合对不同品种紫花苜蓿根颈POD活性的影响

2.4 水磷组合对紫花苜蓿根颈SOD活性的影响

如表4所示，不同磷肥施用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’根颈SOD活性均在W2处理下最高，说明灌水时间间隔为8 d时SOD活性最强。在不同的灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’的根颈SOD活性在各磷肥用量处理下均显著高于CK(P<0.05)，其中以P2处理最高，其‘骑士T’在W1、W2、W3处理下根颈SOD活性较CK分别提高了34.64%，21.98%和42.18%，‘公农1号’较CK分别提高了52.02%，42.03%和26.71%，说明施用磷肥能增强不同灌水时间间隔处理下紫花苜蓿根颈的SOD活性，且在P2O5施用量为100 kg/hm2时SOD活性最强。

表4 水磷组合对不同品种紫花苜蓿根颈SOD活性的影响

2.5 水磷组合对紫花苜蓿根颈SP含量的影响

如表5所示，不同磷肥施用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’的根颈SP含量均在W2处理下最高，说明灌水时间间隔为8 d的处理促进根颈中SP积累的效果最显著。在不同的灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’的根颈SP含量在各磷肥用量处理下均高于CK，其中P2和P3处理的SP含量均显著高于CK(P<0.05)，说明适量的施用磷肥，能提高不同灌水时间间隔处理下紫花苜蓿根颈的SP含量，且在P2O5施用量为100和150 kg/hm2时效果最佳。

表5 水磷组合对不同品种紫花苜蓿根颈可溶性蛋白(SP)含量的影响

2.6 水磷组合对紫花苜蓿越冬率的影响

如表6所示，不同磷肥施用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’均以W2处理下的越冬率最高。在不同的灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’的越冬率在不同磷肥用量(‘骑士T’W2P1处理除外)处理下显著高于CK(P<0.05)，其中以P2处理的越冬率最高，其‘骑士T’的越冬率在W1、W2、W3处理下较CK分别提高95.77%，59.50%和58.38%，‘公农1号’较CK分别提高70.09%，55.03%和62.52%，说明施用磷肥能提高不同灌水时间间隔处理下紫花苜蓿的越冬率，且在P2O5施用量为100 kg/hm2时越冬率最高。

表6 水磷组合对不同品种紫花苜蓿越冬率的影响

2.7 紫花苜蓿根颈中生理指标及越冬率间的相关性分析

由表7可知，‘骑士T’根颈MDA含量与SP含量无显著相关关系，与CAT、POD、SOD活性和越冬率均呈显著负相关(P<0.05)，POD活性与SOD活性和SP含量均呈显著正相关(P<0.05)，其余指标之间均呈极显著正相关(P<0.01)；‘公农1号’根颈MDA含量与CAT活性、SP含量相关性不显著，CAT活性与POD和SOD活性相关性不显著，MDA含量与POD、SOD活性和越冬率均呈显著负相关(P<0.05)，POD活性与SP含量呈显著正相关(P<0.05)，其余指标之间均呈极显著正相关(P<0.01)。结果表明，苜蓿根颈中抗氧化酶活性、SP含量越高，MDA含量就越低，植物受伤害的程度越轻，苜蓿越冬能力越强。

表7 紫花苜蓿根颈丙二醛与抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量及越冬率的相关性分析

3 讨 论

植物受到逆境胁迫后，体内会产生活性氧、自由基等对植物有伤害作用的物质，继而会开启植物体内的抗氧化酶系统，抗氧化酶系统中的CAT、POD、SOD等酶可清除这些有害物质[17]。本研究表明，在施磷量相同的条件下，随着灌水时间间隔的延长，紫花苜蓿根颈CAT、POD和SOD活性大多呈现出先升高后降低的变化趋势，说明轻度水分胁迫能诱导抗氧化酶活性增强；在相同灌水时间间隔处理下，随着磷肥施用量的增加，‘骑士T’和‘公农1号’苜蓿根颈中CAT、POD和SOD活性大多表现为先升高后降低的变化趋势，说明在水分胁迫条件下适量增施磷肥，可增强紫花苜蓿根颈中的抗氧化酶活性，进而减缓细胞膜脂过氧化，延缓细胞衰老。

可溶性蛋白是能对生物膜和细胞质起到保护作用的渗透调节物质，具有较强的亲水特性，可提高细胞的保水能力[18]，是分析植物抗寒性的重要指标。李佳欢等[19]的研究表明，适度干旱胁迫处理可增加苜蓿根颈中的可溶性蛋白含量，本试验结果与其一致，可能是因为适度延长灌水时间间隔使植物细胞中蛋白水解酶类活性增强，导致不可溶蛋白质向可溶性蛋白质转化[20]，进而使可溶性蛋白含量增加。另外，随着磷肥施用量的增加，‘骑士T’苜蓿根颈可溶性蛋白含量在相同灌水时间间隔处理下均呈增长的趋势，‘公农1号’苜蓿根颈可溶性蛋白含量在相同灌水时间间隔处理下呈先增长后降低的趋势，说明水分胁迫条件下适量增施磷肥能促进根系生长及养分吸收，缓解水分胁迫对植物正常生命活动的限制，并且磷作为植物体内蛋白质的重要组成部分，促进了紫花苜蓿根颈中可溶性蛋白的积累，而过量的磷肥则对可溶性蛋白的积累有抑制作用。

MDA是细胞膜脂氧化过程中产生的一种高活性的过氧化产物，可以与细胞中的多种物质发生反应，进而影响细胞活性氧的代谢过程[21-22]。当土壤的水肥条件不利于植物生长时，会导致细胞中的MDA大量积累，所以MDA含量可作为反映植物受伤害程度的指标[23]。本研究结果表明，随着灌水时间间隔的延长，‘骑士T’和‘公农1号’苜蓿根颈的MDA含量表现为持续增长，说明干旱胁迫时间的延长会导致细胞膜脂氧化过程加重，这与陈雅婷等[24]和张银敏[25]的研究结果一致；且随着磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根颈的MDA含量在相同灌水时间间隔处理下均表现为先降低后升高的趋势，说明适量增施磷肥，可提高抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量，进而增强紫花苜蓿抵御水分胁迫的能力。

本研究结果表明，随着灌水时间间隔的延长和磷肥施用量的增加，‘骑士T’和‘公农1号’紫花苜蓿的越冬率均呈先升高后降低的趋势，且在相关性分析中，越冬率与CAT、POD、SOD活性和可溶性蛋白含量均呈显著正相关关系，与MDA含量呈显著负相关关系，说明轻度水分胁迫与适量磷肥组合处理，能促进紫花苜蓿根颈中的抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的增加，进而降低MDA含量，缓解细胞膜脂氧化，保证生物膜系统的完整性及生理代谢的正常进行[26]，降低紫花苜蓿对不良环境的敏感度[11]，从而提高其抗寒性，有利于其安全越冬。

4 结 论

‘骑士T’和‘公农1号’苜蓿根颈的POD、SOD活性、可溶性蛋白含量及越冬率均在灌水时间间隔为8 d时达到最大值，CAT活性在此灌水时间间隔处理下也较高；‘骑士T’和‘公农1号’苜蓿根颈的POD和可溶性蛋白含量在P2和P3处理下均显著高于CK(‘公农1号’苜蓿根颈的W3P3处理除外)；W2P2处理的总体效果最好，该处理‘骑士T’根颈MDA含量较CK降低51.84%，CAT、POD、SOD活性以及可溶性蛋白含量和越冬率较CK分别增加了45.12%，58.11%，21.98%，38.18%和59.50%；‘公农1号’根颈MDA含量较CK降低51.18%，CAT、POD、SOD活性以及可溶性蛋白含量和越冬率较CK分别增加了83.56%，59.65%，42.03%，62.06%和55.03%。因此建议，科尔沁沙地建植苜蓿，水磷耦合的组合宜为灌水时间间隔为8 d，磷肥(P2O5)施用量为100 kg/hm2。