张红娟，朱德鹤，杜琳颖，毛虎德

(1杨凌职业技术学院 生物工程分院，陕西 杨凌712100；2西北农林科技大学 a 植物保护学院，b生命科学学院，陕西 杨凌712100)

植物的生命周期中会遇到各种外源和内源因素引起的渗透变化，因而进化出多种机制来感知、响应和适应这些胁迫。干旱和高盐胁迫是全球植物生长和作物生产的2大非生物限制因子[1-2]。植物在感知干旱和盐胁迫信号后，会快速启动多种信号级联反应以激活或抑制特定基因的表达，进而调节植物体的新陈代谢和生理机能，以应对外界的逆境[3]。干旱胁迫主要是渗透胁迫，而盐胁迫除了渗透胁迫外还有离子毒性作用[4]。Kiyosue等[5]从脱水处理1 h后的拟南芥(Arabidopsisthaliana)中分离到16个早期脱水响应(early response to dehydration，ERD)基因[5]。ERD4蛋白包含高一个度保守的功能未知结构域221(domain of unknown function 221，DUF221)，该结构域在各种物种中都较为常见[6-8]。渗透胁迫和其他胁迫刺激可引发植物胞质游离钙离子浓度的增加。研究表明，拟南芥在胁迫处理下的初级反应表现为细胞质中钙离子的增加，包括高渗诱导的细胞质钙离子增加(hyperosmolality-induced cytosolic [Ca2+] increase,OICICyt)和盐胁迫诱导的细胞质钙离子增加(saltstress-induced cytosolic [Ca2+] increase,SICICyt)[9-11]。因此，了解植物中钙离子参与的渗透传感级联反应对研究植物响应干旱胁迫的机制至关重要。

在细菌细胞中，渗透胁迫是由机械力敏感通道(mechanosensitive channel,MSC)感知，进而影响细菌细胞的细胞膜拉伸以及细胞膜与细胞壁的相互作用，细菌中有2种机械敏感通道，分别为MscL和MscS[12]。Hedrich[13]在拟南芥中发现了2个MSC同源基因AtMCA1 (mid1-complementing activity1)和AtMCA2。Yuan等[14]分离出几个OICI拟南芥突变体(osca1)，并进一步确定高渗透门控钙离子通道1(OSCA1)可能是拟南芥的渗透传感器。有研究人员利用低温电子显微镜(cryo-EM)对OSCA1.1、OSCA1.2和OSCA3.1的蛋白结构进行了分析，发现OSCA蛋白属于一类新的MS离子通道[15-17]。随后，在拟南芥[14]、水稻[18]和绿豆[19]等物种中鉴定到多个OSCA家族成员，其中部分基因对高盐、干旱等非生物胁迫有明显响应，表明OSCAs在植物非生物胁迫信号的感知和胁迫响应基因表达的调控中发挥作用。

小麦(TriticumaestivumL.)在全球的种植面积很广，是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国重要的粮食作物。然而近几十年来，全球气候持续恶化，小麦在干旱、高温、盐碱等非生物胁迫的影响下，产量和品质受到严重影响。我国是一个水资源匮乏的国家，干旱缺水是制约我国小麦生产的主要因素之一。因此，研究小麦的抗旱机理，采取相应措施降低逆境伤害，对提高小麦产量及保障我国粮食安全具有重要意义。本研究鉴定了小麦OSCA家族(TaOSCAs)成员，并分析了其间的系统发育关系，以及在不同发育阶段、不同组织和干旱胁迫下的表达情况，为小麦TaOSCA基因家族的功能验证及机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

小麦品种中国春种子，由本课题组繁殖保存。

1.2 TaOSCA基因的全基因组鉴定

从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)下载15个拟南芥OSCAs蛋白(AtOSCAs)序列作为目的序列，在小麦基因组数据库(IWGSCRefSeq1.1)(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)进行BLASTP检索，以获得小麦TaOSCA候选基因的蛋白质序列，合并去除重复序列后，余下的蛋白序列用Pfam (http://pfam.xfam.org/)及SMART(http://smart.embl.de/)筛选鉴定，将存在DUF221(PF02714)和其他典型保守结构域的OSCAs作为TaOSCA家族成员。

1.3 TaOSCA的系统发育分析

从植物转录因子数据库(http://gramineaetfdb.psc.riken.jp/)中下载获得水稻、拟南芥、二穗短柄草、杨树、小立碗藓和卷柏的OSCA家族的全长蛋白序列，利用ClustalX 1.83软件[20]对这些OSCA蛋白序列进行比对，通过MEGA 5.0，以邻近法(NJ)构建系统发育树，具体分析参数如下：模型/方法为泊松模型， 设定位点间速率变异模式为统一速率，遗传距离计算模型空位/缺失数据处理为部分删除，建树检验方法设为步长检验，检验次数设为1 000次。

1.4 TaOSCA基因结构及其蛋白跨膜结构域分析

利用从Ensemble Plants 数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)下载的小麦基因组注释文件(Triticum_aestivum.IWGSC.gff3)对鉴定到的TaOSCA基因结构进行分析，并使用TBtools[21]进行可视化。采用TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对鉴定到的TaOSCAs蛋白的跨膜结构域进行注释，并利用GSDS 2.0(GSDS；http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)进行可视化分析。

1.5 TaOSCAs的时空表达谱分析

从小麦功能基因组表达数据库(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Expression)中下载小麦不同时期、不同组织器官(苗期的根与叶，营养生长期根、茎、叶、穗，生殖生长时期根、茎、叶、穗、籽粒)的TaOSCAs转录组数据，使用Cufinks和TopHat分析TaOSCAs基因表达情况，并计算每个TaOSCA的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapp-ed)。TaOSCAs在不同发育阶段小麦各器官中的相对表达量用TBtools[21]进行可视化。

1.6 TaOSCAs的表达分析

用Primer 5.0、DNAMAN软件设计TaOSCA基因引物，用荧光定量仪进行筛选，选择扩增效率高、稳定性好的特异引物(表1)用于试验。引物由擎科生物公司合成，预期扩增片段大小为80～250 bp。

表1 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物序列

用体积分数0.1%次氯酸钠溶液浸泡中国春小麦种子5 min，然后用灭菌的去离子水漂洗3次，每次5 min。消毒后的种子置于装有润湿滤纸的培养皿中室温催芽2～3 d后，转移至装有营养液(0.1 mmol/L KCl,0.75 mmol/L K2SO4,0.65 mmol/L MgSO4,0.25 mmol/L KH2PO4,1.0 mmol/L MnSO4,1.0 mmol/L ZnSO4,0.1 mmol/L EDTA-Fe,2.0 mmol/L Ca(NO3)2,0.005 mmol/L (NH4)6Mo7O24,0.1 mmol/L CuSO4)的水培盒中，在16 ℃/14 ℃(昼/夜)、16 h/8 h(光照/黑暗)条件下培养2～3周。待小麦幼苗长至两叶一心时将根部浸没在200 g/L的PEG-6000溶液中进行渗透胁迫，于处理后0，1，3，6，12，24 h取小麦幼苗的叶片样品，液氮速冻后，于-80 ℃冰箱保存。

以TaActin1(ID：TraesCS1A02G274400)为内参基因，采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测TaOSCAs的表达情况。用植物RNA小量提取试剂盒(Magen，R4151-02)提取不同干旱胁迫条件下小麦总 RNA，按HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书反转录合成cDNA，备用。定量试剂盒为诺唯赞ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Q311-02)，反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，10 mmol/L上、下游定量引物各0.4 μL，Template cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。程序为：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，循环40次。3次重复试验，每样品3次技术重复。以2-ΔΔCt方法计算TaOSCAs的相对表达水平[22]。

2 结果与分析

2.1 TaOSCAs的鉴定及系统进化分析

根据植物OSCA家族的保守结构域 DUF221，在小麦中国春参考基因组蛋白数据库中共鉴定出 39个OSCA蛋白。为明确OSCA家族基因在植物中的进化及亲缘关系，将水稻、拟南芥、二穗短柄草、杨树、小立碗藓和卷柏中的OSCA与小麦OSCA蛋白全长序列以邻近法构建系统进化树，结果见图1。

Os.水稻；At.拟南芥；Bradi.二穗短柄草；Pt.杨树；Pp.小立碗藓；Sm.卷柏

图1表明，OSCA分为OSCAⅠ、OSCAⅡ、OSCAⅢ和OSCAⅣ等4个亚家族, 分别有46，40，14和10个成员。TaOSCA 虽在每个亚家族中都有分布，但在OSCAⅠ和OSCAⅡ亚家族中分布较多，分别有16和17个成员，说明OSCAⅠ、OSCAⅡ组蛋白在小麦响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用；二穗短柄草的OSAC家族蛋白在每个亚家族的分布与小麦类似，表明二者的亲缘关系较近。

为比较小麦中TaOSCAs的进化关系，剔除DUF221结构域不完整的OSCA1.5-1A、OSCA2.1-5A、OSCA4.1-4D和OSCA4.1-5A,利用剩余的35个TaOSCAs的蛋白全长序列构建系统进化树，结果见图2。图2表明，TaOSCA家族的成员分为4个亚家族，分别命名为TaOSCAⅠ(包括TaOSCA1.1/1.2/1.3/1.4/1.5/1.6)、 TaOSCAⅡ(包括TaOSCA2.1/2.2/2.3/2.4/2.5/2.6)、TaOSCAⅢ(TaOSCA3.1)和TaOSCAⅣ(TaOSCA4.1)，其成员数量差距悬殊，分别有 15，16，3和1个，这可能与其所发挥的作用有关。

2.2 TaOSCA基因结构分析

研究表明，基因家族成员间外显子/内含子多样性在基因家族的进化中起着重要作用，外显子-内含子结构的差异主要由3种机制形成：外显子/内含子的获得/丢失、外显子的插入/缺失、假外显子的插入/缺失[23]。利用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)可视化TaOSCA基因的全长cDNA序列和相应的基因组DNA序列，确定TaOSCAs中外显子和内含子的数量和位置，结果见图2。图2表明，除TaOSCA4.1-4B外，其余TaOSCA基因均包含多个外显子。此外，在系统发育树的同一进化枝中，大多数成员具有几乎相同的内含子/外显子结构和内含子相位。

2.3 TaOSCA的跨膜结构域分析

使用TMHMM Serverv.2.0预测TaOSCAs中的跨膜结构域(TMs)，结果如图3所示。由图3可以看出，不同的TaOSCA成员包含5～11个TMs，除TaOSCA1.3-1A/1D、TaOSCA2.2-5A/5B/5D、TaOSCA2.3-4A/4B/4D、TaOSCA2.5-5A/5B/5D和TaOSCA3.1-2A/2B外，不同染色体组上的同源TaOSCAs的TMs数量和位置相同，如TaOSCA1.1-3B/3D 均有9个TMs，TaOSCA1.1-1A/1B/1D均有8个TMs，结果表明编码这些同源蛋白基因在不同染色体组的进化中是保守的，可能存在功能冗余。

图3 TaOSCA跨膜结构域分析

2.4 TaOSCA时空表达谱分析

为了揭示TaOSCAs在小麦中的潜在功能，利用公共开放的转录组数据分析TaOSCA基因在小麦不同发育阶段各器官中的表达情况，结果见图4。由图4可以看出，TaOSCA基因家族不同成员在转录水平的表达模式具有差异性。TaOSCA1.1-3B/3D、TaOSCA1.2-1A/1B/1D、TaOSCA1.3-1A、TaOSCA1.6-1A/1D和TaOSCA3.1-2B/2D在整个生育时期高水平表达，表明其在小麦整个生长发育过程中发挥作用；而TaOSCA1.4-2A/2B/2D在不同生育时期的根中高表达，TaOSCA1.5-1B/1D在生殖生长期穗中高表达，TaOSCA1.6-1B和TaOSCA2.6-3B/3D在生殖生长期在籽粒中高表达，表明这些基因在该时期及组织发挥重要作用。

图4 TaOSCA在小麦不同生育期各器官中的表达情况

2.5 TaOSCAs渗透胁迫表达水平

渗透胁迫处理不同时间后TaOSCA在小麦叶片中的表达情况如图5所示。由图5可以看出，总体而言，与对照(胁迫0 h)相比，在渗透胁迫条件下，TaOSCA2.4和TaOSCA4.1表达水平下调，TaOSCA2.5表达水平无显著变化，其余11个基因表达上调。结果表明，TaOSCAs可能参与小麦与渗透相关的信号通路，并在小麦的非生物胁迫响应中发挥关键作用。

图5 渗透胁迫处理不同时间TaOSCA在小麦叶片中的表达情况

3 讨 论

在基因家族的进化过程中，外显子和内含子的结构差异发挥了重要作用[23]。本研究结果表明，除TaOSCA4.1-4B外，其余TaOSCA基因均包含多个外显子，此外在系统发育树的同一进化枝中，大多数成员具有几乎相同的内含子/外显子结构和内含子相位，暗示这些成员可能具有相似的功能。本研究在小麦全基因组水平鉴定到35个OSCA家族成员，其可分为4个亚家族。小麦和二穗短柄草OSCA蛋白序列的聚类结果表明，这2种植物之间系统发育较为保守，这符合短柄草与小麦拥有共同祖先的结论[24]。在拟南芥osca1中过表达OsOSCA1.4可回补突变体中的高渗性诱导的细胞质钙离子增加(OICICyt)、盐胁迫诱导的细胞质钙离子增加(SICICyt)、根生长以及气孔运动等表型[25]，本研究中TaOSCA1.6和OsOSCA1.4在系统发育上聚在同一进化枝上，暗示TaOSCA1.6可能在小麦中发挥与水稻OsOSCA1.4基因相似的作用。类似地，在osca1中过表达OsOSCA1.2、OsOSCA1.3可以回补OICICyt、SICICyt、气孔关闭、根系生长以及与干旱相关的叶片失水表型[26]，TaOSCA1.3、TaOSCA1.4分别与OsOSCA1.3、OsOSCA1.2聚在一支上，由此推测TaOSCA1.3、TaOSCA1.4在小麦中可能发挥类似的作用。上述结果说明，小麦OSCA 家族的成员可能与水稻类似，在渗透调节中存在功能冗余。

本研究结果表明，TaOSCA家族的每个成员在不同器官中的表达情况具有多样性，部分TaOSCAs基因以组织特异性模式表达；TaOSCA1.1-3B/3D、TaOSCA1.2-1A/1B/1D、TaOSCA1.3-1A、TaOSCA1.6-1A/1D和TaOSCA3.1-2B/2D在所有发育阶段的所有组织中均高表达，说明这些OSCAs在小麦的整个生长发育过程中发挥作用。作为OSCA高渗透钙通道蛋白家族的成员，大部分TaOSCAs对PEG-6000诱导的渗透胁迫均有响应，这与对拟南芥和水稻OSCA基因的研究结果[5,18]一致。而TaOSCAs在渗透胁迫下表达模式的多样性暗示，其在功能上可能具有差异性。TaOSCA2.4和TaOSCA4.1表达水平在PEG-6000处理下明显下调，TaOSCA2.5表达水平无明显差异，而其他11个TaOSCA基因则均上调表达，表明这11个TaOSCAs可能是响应渗透胁迫的重要成员。TaOSCA1.1，TaOSCA1.3和TaOSCA1.4在渗透胁迫条件下的表达水平上调达5～25倍，表明这3个基因对渗透胁迫有积极响应。本研究结果表明，TaOSCAs是渗透胁迫中的功能参与基因，这为TaOSCAs的渗透调节功能研究提供了进一步的线索。

4 结 论

本研究在全基因组水平鉴定到35个小麦TaOSCA家族成员，其在系统发育上分为4个亚家族，且在亲缘关系上与二穗短柄草更近；基因结构分析结果表明，除TaOSCA4.1-4B外，其余TaOSCA基因均包含多个外显子，且在系统发育树同一进化枝中大多数成员具有几乎相同的内含子/外显子结构和内含子相位；跨膜结构域分析结果表明，TaOSCA家族成员包含5～11个TMs；表达模式分析结果表明，TaOSCA在小麦不同发育时期各器官中的表达具有多样性，且大部分TaOSCA受渗透胁迫的调控。TaOSCA家族成员可能在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中发挥作用，这些发现将有助于对该基因家族的进一步研究，并为转基因抗渗透胁迫植物的创制提供潜在的靶基因。