张国帅 韩金城 许应天

（延边大学农学院，吉林 延吉 1 330002）

0 引言

隐孢子虫呈世界性流行和分布，是引起哺乳动物腹泻的重要致病原虫［1］。目前，已鉴定的隐孢子虫有30多种［2］。我国隐孢子虫传播范围较广，粪—口途径传播是其主要的传播方式。据报道，我国继1986年陈义民等［3］在甘肃省兰州市犊牛中首次发现隐孢子虫后，王妍等［4］在陕西省、吉林省、上海市等地也相继发现了隐孢子虫。

隐孢子虫在牛群中的感染情况相当普遍，其基因亚型较多，包括芮氏隐孢子虫、安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫和牛隐孢子虫等。断奶后，犊牛对隐孢子虫尤为敏感。我国犊牛主要感染的隐孢子虫亚型为牛隐孢子虫和微小隐孢子虫［5］。隐孢子虫严重危害养牛业，是造成犊牛死亡的主要原因之一，并且目前没有有效的针对隐孢子虫病的治疗方法，更多的是要及时进行防控，切断传染源。因此，对隐孢子虫及其基因型检测技术进行研究具有重要意义。

1 病原形态学检测

目前，病原形态学观察依然是最常用的隐孢子虫检测方法。Henriksen等［6］于1981年采用改良抗酸染色法检测隐孢子虫卵囊，在显微镜下可明显区分粉红色的隐孢子虫与其他颗粒物及杂质。该方法是牛隐孢子虫检测方法中应用最为广泛的一种，具有简单、快捷、成本低、对仪器要求不高等特点，但是敏感性较低，并且无法鉴定亚型和基因型，仅适用于初步鉴定。

2 免疫学检测

现阶段常见的免疫学检测隐孢子虫的方法有酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）等。该试验不需要浓缩粪便样品就能够快速检测大批量粪便样品，卵囊检测限为103～104个/mL。免疫学检测与病原形态学检测相比有着更高的敏感度和准确性，并且消除了病原形态学检测存在的主观性。但免疫学检测也无法确定隐孢子虫的基因亚型，只能用于初步检测。

3 分子生物学检测

目前，应用于牛隐孢子虫及其虫种鉴定研究的分子生物学技术有聚合酶链式反应、环介导等温扩增、基因芯片、DNA测序技术等［7］。

3.1 聚合酶链式反应

1991年，Laxer等［8］首次将聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）应用于隐孢子虫的鉴定。自采用常规PCR技术鉴定隐孢子虫以来，延伸出了采用巢氏PCR、定量PCR、PCR-RFLP等检测隐孢子虫的技术。现阶段，小亚基核糖体rRNA（18S rRNA）、卵囊壁蛋白（COWP）、热休克蛋白（HSP70）、肌动蛋白（G-actin）等编码基因常作为分子标记的基因位点。其中，隐孢子虫18S rRNA基因保守性高，容易设计PCR引物。因此，大多数学者采用18S rRNA作为基因位点，能够鉴别几乎所有的隐孢子虫亚型。

3.1.1 常规PCR。Laxer等［8］首次使用PCR技术检测隐孢子虫。宰德富等［9］从牛和人粪便中的微小隐孢子虫提取出DNA，然后克隆出一个2.3 kb的微小隐孢子虫DNA片段，选择其中一条452 bp片段为靶序列，并且设计了一对含有26个碱基的引物和两个含有20个碱基的探针［9］，证实了该引物为特征性片段。马良等［10］利用聚合酶链反应（PCR）原理建立一种敏感且特异的方法（常规PCR）检测人和动物粪便标本中的微小隐孢子虫，证明常规PCR方法的敏感性明显高于传统病原分离鉴定和血清学鉴定。常规PCR鉴定具有成本低、敏感性高、适合大数量检测的优点，但扩增产物需要纯化测序，浪费时间，且易出现假阳性或假阴性的结果。

3.1.2 巢式PCR。巢式PCR是鉴定牛隐孢子虫亚型最常用的聚合酶链式反应技术之一。Balatbat等［11］在1996年首次使用巢式PCR（Nested-PCR）检测隐孢子虫，用两段引物成功扩增出一条400 bp的特异性片段，在抗酸染色法检测为阴性的28例样本中检测出4例阳性样本，发现巢式PCR技术比病原形态学观察敏感性更高、特异性更强、稳定性也更好。王权等［12］应用巢式PCR对牛粪便中的隐孢子虫进行检测，每克粪便最少检测出5个卵囊，其敏感性比常规PCR高100倍。严若峰等［13］使用巢式PCR、普通PCR及病原形态学观察对比检测隐孢子虫，119份样品中有5例普通PCR检测为阴性，而巢式PCR检测为阳性，在隐孢子虫卵囊含量较低的样本中普通PCR很难检出，而巢式PCR较普通PCR更为敏感，提高了低含量样本中成功检测的可能性。张龙现等［14］完善了巢式PCR检测体系，成功扩增出820 bp特异性反应条带，卵囊最低检测值≤2.86个/mL，敏感性大大提高。虽然巢式PCR的敏感性很高，但极易被污染，尤其是应用于牛隐孢子虫的检测时。这是因为粪便杂质较多，会导致DNA扩增受到限制。因此，检测人员应该严格把控DNA的提取，防止样本杂质过多影响试验结果。

3.1.3 定量PCR。Homen等［15］建立了用于检测牛微小隐孢子虫的定量（Real-time）PCR方法，以肌动蛋白为基因位点对209份样品进行检测，并与巢式PCR进行对比，发现Real-time PCR比巢式PCR检测率高16.7%，但此方法只能用于检测微小隐孢子虫，其他亚型无法特异性扩增。Burnet等［16］针对牛感染隐孢子虫亚型建立了新型Real-time PCR，基于18S rRNA基因位点设计通用型的TaqMan测定法，可以特异性检测出牛源隐孢子虫，解决了以往一次只能检测一种隐孢子虫亚型的问题，节约了检测时间，便于大批量检测。与巢式PCR相比，定量PCR反应敏感度高、耗时短，可以实时监测DNA的扩增操作。但试验证明，在样本中PCR抑制剂较多、卵囊相对较少的情况下，巢式PCR检测方法比较理想。

3.1.4 反转录PCR（RT-PCR）。反转录PCR检测是针对隐孢子虫的mRNA进行检测的，因此，mRNA的提取为该检测技术的重点，其中卵囊破裂的强度被认为是影响mRNA提取质量的关键因素。Garces等［17］将磁珠法和异硫氰酸胍/酚/氯仿法进行对比，发现磁珠法能够更好地打破卵囊壁并能保证mRNA的完整性，且灵敏度是异硫氰酸胍/酚/氯仿法的2.6倍以上。Jenkins等［18］采用定量实时冰冻病毒RT-PCR、半定量冷冻病毒RT-PCR、巢式PCR检测卵囊，结果表明：定量实时冰冻病毒RT-PCR和半定量冷冻病毒RT-PCR可用于检测卵囊含量较低的样品（低于5个），敏感度较高；RT-PCR相较于巢式PCR不需要进行两次PCR检测样品，节约了检测时间。同时，由于RT-PCR在单个试管内即可完成检测，这使得样品被污染的可能性显著降低。由于失活的隐孢子虫不能产生mRNA，所以该技术不能对失活的隐孢子虫进行检测。但也正因如此，可利用RT-PCR的这一特点对隐孢子虫的活性进行检测，这对隐孢子虫的亚型分析及跟踪隐孢子虫病的暴发有重要意义。

3.1.5 多重PCR。彭昊等［19］采用多重PCR成功检测出微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫，此方法最低可检测到1 g粪便中500个卵囊。Santin等［20］采用多重PCR方法鉴别赖氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫，但该方法检测到的微小隐孢子虫反应条带为400 bp，安氏隐孢子虫反应条带为350 bp，条带差异仅为50 bp。虽然多重PCR能够特异性地检测样品且具有较高的敏感性，但在电泳鉴定时对所用Maker、琼脂糖及结果辨识区分能力上要求较高。多重PCR与单一PCR不同，单一PCR只能检测一种基因，而多重PCR可同时检测多种基因型或者同一基因的不同基因亚型，极大地节约了成本及检测时间。

3.1.6 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）。Xiao等［21］在1991年首次采用PCRRFLP检测隐孢子虫亚型，先应用巢式PCR技术扩增隐孢子虫18S rRNA基因，随后采用SspⅠ和VspⅠ对扩增出的特异性片段进行酶切，成功鉴定了微小隐孢子虫、贝式隐孢子虫、鼠隐孢子虫和蛇隐孢子虫。王鹤磊［22］采用PCR-RFLP技术，将巢式PCR第二轮扩增产物利用限制性内切酶MboⅡ和SspⅠ进行酶切，并将Maker设置在500 bp，通过SspⅠ鉴别出安氏隐孢子虫，随后利用MboⅡ酶切，鉴别了芮氏隐孢子虫、安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫和牛隐孢子虫。PCR-RFLP技术改变了只能通过DNA测序才能鉴定牛源隐孢子虫亚型的情况，并且具有快捷、敏感性高、便于大量操作等优点，为牛隐孢子虫检测提供了新方案。

3.2 环介导等温扩增技术

Karanis等［23］在2007年首次应用环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）检测隐孢子虫，针对隐孢子虫的GP60基因设计了特异性引物，并将扩增的189 bp产物进行凝胶电泳检测特异性，与常规PCR对比敏感度，发现LAMP检测限度为每个检测管1个卵囊，而PCR检测限度为每个检测管1×105个卵囊。LAMP的建立节约了核酸扩增的时间，并且能够检测到卵囊含量低的样本。袁忠英等［24］在2009年首次应用LAMP技术检测牛隐孢子虫，通过隐孢子虫18S rRNA序列设计4条引物进行扩增，并使用SYBR GreenⅠ显色检测，隐孢子虫卵囊特异性显示为阳性。史亚东［25］对LAMP检测体系进行了优化，减少了预变性和酶失活的步骤。优化后的LAMP节约了试验时间，可以实时显示检测结果，并且避免了开盖造成污染的可能。但是，LAMP对特异性的引物要求较高，否则易出现非特异性扩增，因此设计高特异性的引物是这个试验成功的关键。

3.3 基因芯片技术

利用基因芯片技术可以检测牛隐孢子虫卵囊，也可检测牛隐孢子虫虫种。Wang等［26］采用基因芯片与PCR对比，荧光标记片段，采用提前设计的基因型、亚基因型和不同种属的隐孢子虫的寡核苷酸探针进行杂交，发现基因芯片可以排除PCR中出现的假阳性，提高检测的准确度。基因芯片相比PCR可以获得更多的信息量，并且其特异性和灵敏度都很高［27］。基因芯片技术是一种检测牛隐孢子虫及其虫种的前沿技术，但是该方法应用成本较高，暂不适合实际应用。

3.4 DNA测序技术

Laxer等［8］首次应用PCR检测隐孢子虫，并与DNA测序技术相结合鉴定基因型。DNA测序提供了一个准确的参考基因组序列库，广泛应用于牛隐孢子虫检测。这种技术能够评估隐孢子虫物种之间的基因组变异。但是，DNA测序技术的耗材相对较为昂贵，并且耗时较长，因此不适宜大批量检测。

4 其他新兴检测技术

4.1 纳米技术

纳米技术克服了荧光标记不稳定的缺点。Singh等［28］使用半导体作为荧光标记检测微小隐孢子虫卵囊，发现量子点在长达5 min的连续紫外光激发下更具光稳定性。与有机荧光团相比，量子点对水样中其他荧光物质的干扰减少了50%。

4.2 基于芯片技术的生物传感器

Chang等［29］改进了表面等离子体谐振生物传感器，首次将生物素化的单克隆抗体与隐孢子虫卵囊结合形成结合物，通过离心分离的方法，使含结合物的缓冲液通过金属膜。这让目标物更加容易传导至传感器金属表面，便于检测人员实时获得检测结果，且敏感度较高。但是，由于缓冲液的折射率不一致，所以检测结果会受到影响。Thiruppathiraja等［30］开发了一种基于夹心酶联免疫传感的检测水样中隐孢子虫的电化学生物传感器。夹心试验的结构由金纳米颗粒、一抗、卵囊和与金纳米颗粒结合的二抗组成，卵囊检测下限为3个/mL，具有极高的敏感度。该技术提高了分析性能，可实现实时检测及高通量、快速分析，能够减少资源浪费。但是，金纳米价格较为昂贵，无法大范围应用于临床试验。

5 展望

目前，隐孢子虫对养牛业的危害越来越大，牛隐孢子虫检测技术也在不断创新。但截至目前，没有一种检测技术是完美的。传统的病原形态学检测技术依赖于实验室显微镜，检测主观性较强，敏感度低且无法确定亚型。分子生物学检测是目前判断牛隐孢子虫及其亚型最常用的检测技术，敏感度较高，较为经济且适合大批量操作。最先进的纳米技术更加敏感、耐用，具有很高的识别性，但是存在造价昂贵、操作时间过长等缺点。很多学者努力将PCR技术与新发展的芯片技术相结合，期待会有好的效果。经过几十年的努力，隐孢子虫的检测技术从最早的病原病态学检测技术，发展到分子生物学技术，以及目前的新兴技术，逐步向着更敏感、快速、特异性的方向发展。优秀的检测技术对于牛隐孢子虫病的防治非常重要。笔者对牛隐孢子虫检测技术进行了汇总，希望能为今后牛隐孢子虫的进一步研究提供理论依据，减少隐孢子虫病对养牛业造成的危害。