刘天梅

（青海省尖扎县畜牧兽医站，青海 尖扎 811200）

现阶段规模化养殖中，由小反刍兽疫病毒引发的小反刍兽疫是一种“三高（高传染、高发病、高死亡）”的RNA病毒性传染病，在损害养殖户经济效益的同时也不利于畜牧业可持续发展目标的实现。鉴于此，本文主要系统化剖析了小反刍兽疫的流行病学，并就诊断技术展开了深入探讨，以便于保证小反刍兽疫预防和消灭工作的高效化开展。

1 流行病学

小反刍兽疫的致病原为小反刍兽疫病毒，与其它病毒相比在形状上，小反刍兽疫病毒多为粗糙的圆形或椭圆形，在pH5.75~9.6结构相对稳定，若周边环境pH值低于4或高于11，则会失活。作为一种急性、烈性以及接触性RNA病毒性传染病，小反刍兽疫的致死率极高，是世界动物卫生组织规定的A类动物疫病类型。

2 临床症状

小反刍兽疫的潜伏期通常为1周左右，发病后的临床表现主要为体温升高（高于41℃）、精神萎靡、眼角处有大量分泌物（浆液性逐渐变成脓性）、毛发凌乱、食欲不佳、口鼻干燥、口腔粘膜干酪样病变、舌面和咽部溃疡、舌背面糜烂、齿龈出现糜烂、口腔黏膜充血、流出大量流涎、乳头坏死、血水样腹泻、孕动物出现流产。经剖析可知，患病的牲畜内部变化也极为明显，具体表现为硬颚至网胃和瘤胃交界处出现溃疡、盲肠和结肠结合处出现斑马样条纹、肺出血、淋巴结肿大以及脾坏死。

3 诊断技术

3.1实验室诊断

3.1.1 AGID 在实验室诊断中，与其它诊断技术相比，经济性、便捷性是“AGID”诊断技术的显著特点。在诊断时首先诊断工作人员可用病畜的肠黏膜、淋巴结等组织制备标准PPRV抗原，并通过高免牲畜获得抗血清，再以“琼脂凝胶”为媒介，将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶中，而后将其放在一定温度下，待一段时间后查看是否有“与阳性对照抗原一样的沉淀线”。这种诊断技术在应用时，往往只能检测烈性PPR抗原，相对地由于温和型PPR抗原本身含有较少的病毒含量，在进行检测时难以出现与阳性对照抗原一样的沉淀线。

3.1.2 捕获酶联免疫吸附试验 小反刍兽疫病毒的结构蛋白主要包括N、P、M、F、H以及L，而捕获酶联免疫吸附试验的检测对象主要是病毒中的用多种抗N蛋白单克隆抗体。在检测时，检测工作人员可对牲畜粪便简单化处理后进行检测，特异性和敏感性是这种检测技术的显著优势，但检测成本相对较高也是这种检测技术存在的现实问题。

3.1.3 CIEP 在病毒抗原检测中，“CIEP”诊断技术的合理化应用具有便捷性的显著特点。在检测时，检测工作人员可以水平电泳槽中（槽内装满0.1 mol/L醋酸巴比妥缓冲液）的凝胶为载体，在正极加血清、负极加抗原，电泳0.5h后左右观察。这项技术在具体化应用时，虽然能快速检测病毒抗原，但却无法有效区分PPRV和牛瘟病毒的感染。

3.1.4 反转录聚合酶链式反应 在实验室诊断中，“反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）”是一种常见的分子生物学检测方法，与其它诊断技术相比，特异性、灵敏性是这种检测技术的显著优势。在检测时，检测人员可设计三对位于F基因的引物进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析，而后在通过建立区分小反刍兽疫疫苗毒与基因四系野毒的RT-PCR检测方法用以检测病毒，但这种检测方式在使用时却存在漏检病毒引物位点变异病毒的劣势，增加了后期防治工作难度。

3.1.5 LAMP 在对小反刍兽疫诊断时，LAMP也是一种比较常用的方法。当前，有研究人员已经针对N基因的保守区域构建起了具体的检测方法。在对反应体系进行优化之后发现，LAMP在检测效率方面得到了显著提升。通常来说，从核酸提取到检测结果的获取只需要60~80min。同时，随着技术的进步LAMP在特异性和灵敏度方面展现出了明显的优势，即使出现同属病毒和类似病毒也不会发生交叉反应。除此之外，LAMP还可以达到可视化的效果。操作时，首先要将小反刍兽疫病毒的RNA核酸提取出来，并使用分光光度来测定浓度，然后保存在-80℃的环境中。在按照试剂盒的说明书进行操作之后，要对小反刍兽疫病毒N基因序列进行生物信息学分析，并设计LAMP引物。最后通过最佳引物筛选试验得到反应的最佳引物，之后可以根据实际需要开展特异性试验和敏感性试验。

3.1.6 IFAT IFAT指的是间接免疫荧光抗体试验。在诊断小反刍兽疫病毒时，操作人员可以基于病毒特异性单克隆抗体来构建试验，将感染发病早期和后期病料中的病毒抗原提取出来，完成鉴别和诊断。与此同时，技术人员还可以将重组小反刍兽疫病毒中的F蛋白作为抗原免疫基础，制作多克隆抗体，以捕获病料中的抗原。同时还需通过间接免疫荧光抗体试验对小反刍兽疫病毒进行特异性诊断。

3.2血清学诊断

3.2.1 中和试验 相比实验室诊断，“血清学诊断”方式的使用不仅具有极高的诊断效益，与此同时在推动畜牧业可持续发展中也发挥了重要作用。作为国际贸易指定的试验方式，“中和试验”在具体化应用过程中，工作人员需严格按照如下诊断流程进行操作，即：经过灭活待检血清倍比稀释→加入103TCID50/mL的病毒悬液→置于37℃下1h→每个梯度中取出0.2mL混合物于转管内→加入1mL Vero细胞悬液→置于37℃倒置培养→3d后弃去出现CPE的培养管→更换维持液→旋转培养1周→检测。这项检测技术虽然具有灵敏、特异的优势，但却无法用以大规模临床检测。

3.2.2 分子生物学与胶体金技术 在血清检测中，“特异性好、能够检测微量病毒”是“分子生物学与胶体金”诊断技术的显著优势，在检测时，具体检测作业流程如下：对小反刍兽疫病毒N基因的高度保守区设计两条特异寡核苷酸探针→形成“生物素化探针-靶核酸-纳米金探针”复合物通过生物素-亲和素系统→固定在固相载体上→银染放大信号。

3.2.3 酶联免疫吸附试验 （1）竞争酶联免疫吸附试验 当动物感染了小反刍兽疫病毒之后，它们的血清单体中会产生专门针对这种病毒的N蛋白和H蛋白。竞争酶联免疫吸附试验就是针对这两种蛋白质而进行检测的技术，它可以通过单克隆抗体的形式来完成检测。与传统的检测方法相比，酶联免疫吸附试验具有方便、快捷的特征，即使是在野外也可以对大量的样品进行诊断，敏感性为94.5%、特异性为99.4%。但竞争酶联免疫吸附试验无法对小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒进行区分，因此需要其他的方法作为辅助来进行区分。（2）间接酶联免疫吸附试验 间接酶联免疫吸附试验在操作的时候要先将抗原吸附到酶标板上，然后向其中加入小反刍兽疫病毒的特异性血清。在经过孵育之后加入酶结合物和底物，并对血清中所含有的特异性抗体检测。小反刍兽疫病毒中的N蛋白中，第454~472位的氨基酸序列呈现出了免疫原性，这是该病毒特异性的体现。与此同时，小反刍兽疫病毒的B细胞表位在第452~472的区域，该区域的多肽抗体可以对病毒进行特异性识别。间接酶联免疫吸附试验就是在这个基础上所产生的，它可以将小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒进行鉴别，实现了诊断效果的提升。但这种方法在实际操作的过程中容易受到其他蛋白的干扰和影响。（3）夹心酶联免疫吸附试验 在夹心酶联免疫吸附试验操作的过程中，需要先将待检测样品与特异性抗体融合，形成免疫复合物，然后将其与预先包被在酶标板上的捕获抗体结合，在这之后就可以按照常规的方法，在样品中加入酶结合物和底物检测。这种检测方法的原理是利用了小反刍兽疫病毒N蛋白表位的单抗。这种试验方法的特异性能够达到92.8%，敏感性则为90%左右，实验结果的获得时间通常在2h左右。

4 小反刍兽疫的预防

4.1免疫预防对小反刍兽疫防控，要坚持预防为主的原则。该病具有较强的感染性，一旦有动物发病，就会在短时间内传染给其他动物，在不加控制的情况下会大规模的暴发。因此，养殖场要做好免疫预防的工作，通过接种小反刍兽疫疫苗的方式来达到免疫的效果。现有疫苗的有效期通常为3年，相关人员需要按照规定的时间和流程来为养殖场动物接种疫苗，在疫苗到期的末端还要及时续免。

4.2加强疫情的排查与检测在小反刍兽疫防治的过程中，地区防疫部门要发挥应有的作用，除了对养殖户进行宣传之外，还要定期做好疫情的排查和监测工作。根据小反刍兽疫在每5~6年会流行一次的情况，在流行区复发时间，防疫工作者需要做好疫情的监测与记录，为养殖人员提供指导。同时，还要与屠宰部门相互配合，做好及时有效的检测与预防。如果发现疑似病症及时做好实验室确诊的工作。

4.3做好应急防控准备由于小反刍兽疫的传染性比较强，在发生疾病时做好应急防控准备是十分有必要的。具体来说，防疫部门要提前构建起应急防控体系，在疫情发生之后启动应急预案，对整个疫区进行隔离。对急性小反刍兽疫患病动物，要进行扑杀，并对尸体进行无害化处理。除此之外，还要对养殖场进行监督与管理，要求其做好杀菌与消毒的工作，避免疫情进一步的扩散。

5 结语

在牲畜规模化养殖中，小反刍兽疫诊断技术虽然已经十分成熟，但随着疫病的频发，为保证畜牧业的可持续发展，建立便捷、快速、安全的检测体系落实检测工作，是高效化预防“小反刍兽疫”的有效渠道。