张 浩 赵 婧 葛小宁 董雅儒

甲状腺相关性眼病(TAO)是Graves病(GD)最常见的甲状腺外表现[1]。大约50%的GD患者在一年至数十年可发展为TAO，而在TAO患者中，大约80%的患者会在18个月内发展为甲状腺功能亢进[1]。临床上大约10%的TAO患者在诊断为甲状腺功能障碍前，因严重的眼部症状就诊于眼科门诊[2]。TAO复杂的临床表现(如单侧眼球突出)及其相似疾病(如眼眶肌炎、重者肌无力以及IgG4相关免疫疾病)等加大了TAO的诊断难度[3-4]。

生物标志物可以是任何类型的特异性分子标记物、特定的临床特征、影像学特征或临床评分等，其有助于实现TAO早期诊断，评估其严重程度及预后。TAO的早期阶段为自身免疫过程，其活跃性在13～24个月达到峰值[5]。若能对TAO实现早期诊断并给予相应干预，从而控制其进一步恶化，将明显改善患者的生活质量[6]。

1 TAO危险因素及发病机制

TAO是由内源性和外源性因素共同导致的。前者包括年龄、性别和遗传等因素。据报道，TAO在女性中的发病率约为男性的3.7倍，而重度TAO往往倾向于男性，且男性平均年龄大于女性[6]。目前在遗传因素方面尚未取得重大进展，特别是区别患有或不患有TAO的GD患者[2,7-8]。此外，吸烟和放射性碘治疗史为TAO恶化的外源性危险因素[9]。

TAO与GD在发病机制上存在紧密联系，两种疾病都与促甲状腺激素受体(TSHR)的表达有关。该受体在甲状腺细胞和眼眶组织的成纤维细胞中同时存在，B细胞识别作为抗原的TSHR产生相应抗体，从而导致自身免疫反应。此外，胰岛素样生长因子I(IGF-1)可促进眼眶脂肪干细胞的增殖分化和脂质堆积。值得注意的是，TSHR与IGF-1R之间存在交叉抗原，TSHR抗体能激活IGF-1R，促进IGF-1的产生，从而造成突眼[10]。另有研究表明，TSHR与IGF-1R可形成功能复合体，两者发挥协同作用，可表达多种细胞因子并促进透明质酸累积，促使眼部炎症发生，继而肌腹增粗和脂肪组织扩张造成突眼[11-12]。

2 TAO的诊断局限性

TAO早期诊断重点在于评估其活动性。目前临床常用临床活动评分(CAS)评价，其通过眼睑、结膜、泪阜红肿、自发性眼球后疼痛及眼球转动痛等指标来评估TAO活动性，从而决定是否给予激素治疗。但对于CAS、NOSPECS、VISA以及EUGOGO等评分量表而言，其都存在明显局限性，如主观的量表评估多取决于评估的时机、患者对其临床症状的主观感受以及进行评估的医师专业水平，同时评估的临床信息类型不同，因此也大大降低了其解释的准确性[13]。此外，TAO的眼部病变可发生于甲状腺功能正常、亢进及减退时，故甲状腺功能异常病史对TAO诊断仅有一定的参考意义[14]。

甲状腺激素受体抗体(TRAb)是临床上常用的TAO诊断生物标志物，但目前TRAb水平与TAO的关系仍存在争议[15]。多项研究表明，TSHR刺激性免疫球蛋白(TSI)水平与TAO的发生率、严重性显著相关[16]。但由于TSI的检测过程较为繁琐、耗时，目前其应用尚局限于专业实验室，未能广泛应用于临床检测。此外，CT和MRI在非典型TAO的初步诊断、手术方案设计以及与其他眼眶疾病的鉴别诊断中起着至关重要的作用，但目前尚未就在疾病发展过程中使用不同成像方式达成共识，有待进一步商榷[17]。

3 TAO生物标志物

生物标志物在疾病状态下常常存在于各种体液，如尿液、血清、泪液、淋巴液等[18]。眼眶脂肪和眼外肌活检是极具侵入性的样本采集方式，虽不适合临床早期诊断，但对TAO发病机制研究具有不可替代的作用。本文将根据样本来源类型对近年来TAO诊断相关的分子生物标志物研究进展予以综述。

3.1 血液中TAO生物标志物的研究进展

3.1.1 TSHR刺激性免疫球蛋白TRAb在自身免疫性甲状腺病患者体内特异性存在。根据TRAb对TSHR的不同作用，可分为TSI、TSHR抑制性免疫球蛋白(TBI)和中性抗体。研究发现，TSI和TRAb水平均与TAO的严重程度和临床活动性呈正相关，但TSI是更敏感的血清学评估指标，更能反映TAO的眼部表现[19-20]。此外，在75例轻度和33例中重度TAO患者中，TSI的检测阳性率均高达94%以上，而TRAb仅为84%和73%[21]。Diana等[22]的多中心研究显示，患有TAO的GD儿童的TSI水平显著高于仅患有GD的儿童,两组儿童之间的TRAb水平无显著差异；经过3年治疗期后，GD儿童的TSI水平降低了69%，而患有TAO的GD儿童降低了20%，证实了血清TSI也是儿童TAO的诊断生物标志物。此外，血清TSI水平与新近发病的甲状腺功能障碍性视神经病变显著相关，可识别新近发病需要紧急治疗的患者[23]。然而，TSI测定可重复性差且需要多个步骤显示出其敏感性和特异性，故目前临床开展难度较大，仍需进一步探究[24]。

3.1.2 硒硒(Se)是甲状腺激素合成和代谢的重要物质之一，它在TAO的发生发展中有着重要的意义[25-26]。流行病学研究表明，TAO的患病率增加与饮食中硒的低摄入量有关,硒缺乏(≤93 μg·L-1)是发生重度TAO的潜在危险因素[27-28]。研究表明，硒对甲状腺完整性的局部保护作用与减少促炎细胞因子的释放有关，适当补硒可降低甲状腺自身抗体水平[29-30]。最近研究发现，血浆硒水平降低不仅可反映TAO的临床活动性，而且与CAS显著相关。故微量元素硒可为TAO的早期诊断和活动性评估提供一定依据，值得进一步探究[31]。

3.1.3 细胞因子细胞因子是具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，具有调控免疫应答、细胞生长和分化的作用。炎症细胞与细胞因子作为炎症级联反应中重要一环可促进TAO进展为活动期。大部分炎症细胞和细胞因子通过旁分泌或自分泌方式，诱导局部炎症的加剧与扩散，进而引发眼部特征性的解剖学、组织学改变[32]。近年来研究已确定的活动期TAO生物标志物有IL-1β、IL-6、IL-17 、IL-15、IL-23、IL-29、CXCL10、CCL2[31,33]。值得注意的是，CCL2是诊断活动期TAO的独立预测因子，且其与CAS结果显著相关[31]。此外，IL-10、IL-8和CCL20水平在TAO患者血液中显著升高，提示这些细胞因子有作为TAO生物标志物的潜力[34-37]。

3.1.4 IgG4IgG包括4种不同的亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其中IgG4在免疫性疾病中具有重要作用[38]。研究发现，IgG4水平是TAO发生的独立相关因素，在TAO患者中，随着CAS的增加，IgG4水平和IgG4/IgG比值均明显升高。与IgG4水平正常组相比，高IgG4水平组患者具有较高的自身免疫性甲状腺疾病家族史发生率、高水平的游离T4、TRAb和高IgG4/IgG比值，当IgG4水平≥1.35 g·L-1时，TAO患者眼部表现多呈双侧对称性[39-40]。众所周知，TSI和CAS为是否抗炎治疗的重要参考指标。然而，TSI所需的生物测定非常难以在临床进行，因此，临床医生仍采用NO SPECS、CAS和眼眶CT/MRI表现来决定激素冲击时机，这种评估方法有时会导致治疗延迟。研究表明，IgG4可诱导TAO患者眼眶成纤维细胞合成透明质酸[39]，还可促进眼眶组织中TRAb的生成[41]，这些结果都提示IgG4水平有助于TAO的监测和诊断新的TAO亚型，并且血清IgG4水平可能是区分TAO急性炎症早期的廉价和易获得的敏感指标。

3.1.5 富含半胱氨酸的血管生成诱导剂61富含半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)是一种分泌型细胞外基质相关信号蛋白，可调节各种细胞活动，包括细胞增殖、迁移、黏附和凋亡等[42]。通常CYR61在正常成年人体内维持较低水平，但在细菌和病毒感染等条件下，CYR61水平显著升高，其通过提供炎症细胞因子来维持炎症微环境[43-44]。研究发现，TAO患者的血清CYR61水平与血清TRAb水平显著相关，并且TAO患者的CYR61 mRNA表达水平较正常组明显升高[45]。此外，CYR61还参与眼眶炎症和眶脂肪生成[46]。因此，CYR61作为活动期TAO的诊断生物标志物显示出良好的潜力。

3.1.6 抗乙醛脱氢酶2抗体乙醛脱氢酶(ALDH)包括胞质ALDH1和线粒体ALDH2，是细胞内同工酶的一大家族，负责将细胞内的醛氧化为羧酸，参与多种细胞活动，如细胞增殖、分化以及细胞氧化应激反应等[47]。同时氧化应激也是TAO发生发展的重要机制之一，目前有学者猜测ALDH2可能是TAO患者的自身抗原， ALDH2可能参与了TAO发展中的氧化应激过程[48]。由于ALDH2是一种细胞内蛋白，其作为自身抗原的作用可能是继发于细胞损伤。Cheng等[49]研究发现，抗ALDH2抗体的滴度在TAO患者较正常对照组显著升高，同时抗ALDH2抗体与TAO的临床活动和严重程度呈显著正相关[49]。这提示抗ALDH2抗体可作为TAO的新型生物标志物，并可在随访期间，通过测量抗ALDH2抗体滴度监测TAO的临床活动性。

3.2 尿液中TAO生物标志物的研究进展

3.2.1 脂质脂质水平的变化与各种代谢性疾病密切相关，在信号转导、细胞增殖和凋亡方面起重要作用。Byeno等[50]通过对GD、TAO患者及健康人的尿液脂质进行定性和定量分析，发现TAO和GD患者的整体脂质曲线基本相似，但是与健康对照组相比存在显著差异；GD和TAO患者的尿溶血性磷脂酰胆碱显著增加，尿磷脂酰胆碱则明显减少，尿甘油三酯降低；与GD患者相比，在TAO患者的尿液样本中1-磷酸鞘氨醇水平显著增加。因此，1-磷酸鞘氨醇水平可以作为鉴别TAO和GD的有力候选指标。这些发现提示，可根据尿液脂质分析来区分GD和TAO患者的状态，从而早期对TAO患者病情进行干预。

3.2.2 糖胺聚糖糖胺聚糖(GAG)作为生物体内重要的生物大分子，广泛存在于细胞表面和细胞外基质中，参与细胞增殖、分化和免疫调节等重要的生物学过程。在TAO发展过程中，TRAb可与眼眶成纤维细胞上的TSHR结合，激活免疫级联反应，促进包括透明质酸在内的GAG的局部合成，在强亲水性透明质酸的积聚下导致结缔组织和眼外肌局部积水和肿胀，进而恶化眼眶的静脉和淋巴循环[51]。已有研究证实,非活动期TAO患者的尿GAG水平与正常人无明显差异，而活动期TAO患者的尿GAG水平比非活动期TAO患者高2～3倍[52]。故若能合理地将CAS和尿GAG测定结果结合起来，可能在区分TAO临床活动性和严重程度上非常有效，并有助于TAO患者的早期诊断。

3.3 泪液中TAO生物标志物的研究进展

3.3.1 8-羟基-2-脱氧鸟苷8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)由受损DNA氧化鸟嘌呤形成，它不仅是活性氧损伤的标志，而且其形成取决于活性氧水平和8-OHdG修复酶的功能，故可用于测量氧化应激中的DNA损伤[53]。有证据表明,TAO的代谢与活性氧紧密相关[1,32]。Tsai等[54]已证实，TAO患者尿液中的8-OHdG水平显著升高,为正常人的1.9倍,这种升高在活动性TAO患者中更加显著，为正常人的2.4倍。近年来研究发现，在TAO患者的眼眶成纤维细胞中，8-OHdG水平显著高于正常对照组，但在眼眶脂肪组织中，8-OHdG含量与正常对照组并无显著差异[55]。然而Choi等[56]研究发现，在活动期TAO患者泪液中，8-OHdG水平显著高于正常对照组及非活动期TAO组，另一方面，活动期TAO组患者的泪液8-OHdG水平与CAS显著相关，而非活动期TAO患者泪液8-OHdG水平与CAS之间不相关，ROC曲线显示，泪液8-OHdG预测活动期TAO的敏感性和特异性分别为95.2%和85.4%。此外，泪液8-OHdG水平与血清T3、T4、FT4之间的并无显著相关性[56]。

3.3.2 丙二醛丙二醛(MDA)是DNA氧化和脂质过氧化最常见的副产物之一[57]。与8-OHdG类似，在TAO患者眼眶成纤维细胞中，MDA水平明显高于正常对照组[55]。此外，活动期TAO患者泪膜中MDA水平明显升高，并且其水平与CAS呈正相关，可良好反映疾病的临床活动性和严重程度。值得注意的是，TAO患者泪液中8-OHdG水平与MDA水平存在显著相关性[56]。

3.3.3 钙结合蛋白A4S100钙结合蛋白参与调节许多重要的细胞活动，如钙稳态、细胞骨架组织、应激反应、细胞运动、细胞增殖和分化等，钙结合蛋白A4(S100A4)为S100钙结合蛋白家族的一员。Ma等[57]证明了S100钙结合蛋白家族(包括S100A4)在健康角膜的角膜缘上皮隐窝的细胞质中高表达，而在发炎的角膜缘中表达显著降低，因此S100A4水平一定程度上代表角膜缘的正常性[58]。在Kadrmas等[59]的早期研究中，角膜缘上皮隐窝被认为与甲状腺功能障碍有关，是严重GD的预后指标。近年来通过定量蛋白质组学分析发现，随着TAO严重程度的增加，S100A4蛋白变化呈明显下降趋势，尽管S100A4蛋白的表达也不是角膜缘所独有的，但TAO自身免疫过程导致的角膜缘炎症增加可能会在泪液中观察到S100A4蛋白的下降趋势，从而反映其疾病的严重程度和活动性，并且S100A4蛋白在轻度和中重度TAO中均下调，这为GD患者是否具有TAO发生倾向提供了一个良好监测指标[60]。

3.3.4 催乳素诱导蛋白催乳素诱导蛋白(PIP)通常在几种外分泌组织中表达，如泪腺、唾液腺和汗腺，其主要作用与宿主防御和免疫调节有关，是CD4+T细胞受体介导凋亡的特异性抑制剂[61]。最近研究发现，PIP在圆锥角膜患者中表达下调，而在TAO患者中显著上调。同时PIP可以间接反映重度TAO患者免疫耐受的破坏和纤维化进程，其表达上调可能意味着患者即将进展为重度TAO，故PIP泪液蛋白可作为监测TAO进展的早期生物标志物[61]。

3.3.5 外泌体蛋白外泌体是30～150 nm大小的胞外囊泡，存在于许多体液中，如血浆、尿液、滑液、乳汁、唾液和泪液[62]。目前泪液外泌体蛋白作为疾病活动生物标志物已在原发性干燥综合征、原发性开角型青光眼和多发性硬化症等中取得显著研究进展[63-65]。在最近研究中，利用高灵敏度的蛋白质组细胞因子阵列试剂盒可以检测泪液中23种外泌体蛋白，其中维生素D结合蛋白、C反应蛋白、基质金属蛋白酶-9和血管黏附分子-1等蛋白在TAO患者外泌体中的表达水平显著高于健康对照组[66]。外泌体数量的增加可能导致其功能的激活和更多炎症细胞因子的释放，从而促进眶内组织重塑和炎症发生。综上所述，泪液外泌体数量的增加和外泌体中特异蛋白的表达可能反映了TAO的病理过程和疾病的严重程度。

3.3.6 溶菌酶CTAO患者泪液中，绝大部分泪液蛋白表达下调，只有少部分泪液蛋白表现为上调，例如溶菌酶C(LYZ)和乳铁蛋白。其中LYZ是人类泪液蛋白的重要组成部分，具有抗菌、抗感染、抗病毒的特性，并在免疫防御中起着相当重要的作用。Aass等[67]研究显示，LYZ不仅在鉴别中重度TAO的GD患者和单纯GD患者中具有意义，对于症状不典型的轻度TAO患者也有显著的鉴别能力，在排除年龄、吸烟和性别干扰因素后，这种相关性仍然显著。值得注意的是，该研究发现，中重度TAO患者泪液中LYZ水平的增加与TRAb水平显著相关，而在轻度TAO患者中不具有统计学意义。此外，在该项研究中，催泪蛋白(lacritin)和锌-α-2糖蛋白(AZGP1)在区分中重度患有TAO的GD患者与单纯GD患者中存在意义。联合应用LYZ、LACRT和AZGP1可形成一个强大的泪液蛋白组合，能够区分GD患者是否伴有TAO，其准确率可高达93%,这有助于TAO的诊断以及其活动性的评估[67]。

3.4 粪便中TAO生物标志物的研究进展

3.4.1 拟杆菌门研究发现，肠道微生物群与TAO相关性状及血清TRAb水平之间存在相关性[68]。TAO患者肠道菌群的组成与TRAb之间的潜在关系可能为TAO相关免疫反应提供新认知。人类肠道主要是厚壁菌门和拟杆菌门寄居，后者多以拟杆菌属和普雷沃菌属为主。多位学者报道普雷沃菌与慢性炎症状态有关，这可能提示与活动性眼眶炎症有关[69]。近年来发现，普雷沃菌属中的Prevotella.copri菌和拟杆菌属与TRAb水平显著相关[69]。这提示了TAO患者拟杆菌门与TRAb之间存在潜在紧密关系。

3.4.2Deinococcus-ThermusDeinococcus-Thermus细菌具有抗氧化、耐干燥和耐高温的特性。在控制平均甲状腺激素水平下，特定的细菌在是否患有TAO的疾病组之间显示出差异性，其中Deinococcus-Thermus细菌尤为显著。研究发现，氧化应激促进TAO的发生，而Deinococcus-Thermus细菌能够合成大量类胡萝卜素，类胡萝卜素可以通过中断自由基的传播来减少氧化应激[70-71]。因而，Deinococcus-Thermus细菌及其代谢产物可能在TAO的诊断中具有一定意义。

3.5 眼眶脂肪中TAO生物标志物的研究进展MicroRNA是一类长度为18～24 nt的非编码RNA分子,它在细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动中发挥重要作用[72]。最近研究发现，TAO患者的眼眶脂肪中的MicroRNA-130a表达显著升高，尤其是在脂质过度积累的TAO患者中，MicroRNA-130a可通过抑制信号通路中的AMPK，参与眼眶内脂肪组织积聚、过度形成及眼眶纤维化过程[72-73]。同时MicroRNA-130a高表达在一定程度上提示了患者进展为重度TAO的可能性[74]。此外，研究发现香烟烟雾可上调MicroRNA-130a的水平，而吸烟也会使TAO的发病率增加约7倍[75-76]。故吸烟是否会增加TAO的MicroRNA-130a水平有待进一步研究。

4 展望

目前TAO的发病机制和生物标志物方面研究已取得一定进展，但鉴于疾病的复杂性以及检测手段的局限性，在临床中开展应用仍然受到限制。用于TAO诊断的高效生物标志物仍有待进一步发现，为了能更大规模地应用到临床，良好的生物标志物来源应该考虑到样本采集的可行性和TAO疾病特征相关性，例如眼眶脂肪或肌肉虽具有高度特异性，但其采集过程是一种侵入性方法，只能待炎症稳定消退后或在眼眶减压手术中收集，这也就意味着这些样本即不能用于基本诊断，也不能用作监测预防。相比之下，常见的生物样本(如血液、尿液、泪液、粪便等)似乎更适合生物标志物研究。然而，截至目前，这些发现转化为临床应用时仍收效甚微。此外，随着高通量技术的持续进步，唾液成为新型生物标志物来源，基于唾液样本的检测有望为TAO的诊断开辟光明的前景。值得注意的是，面对如此复杂的疾病，单一生物标志物并非最佳的候选者，通过不同类型的生物标志物组合或将生物标志物与临床表现和放射学参数相结合的方式可有效提高诊断和监测预后的准确性，从而及时评估病情并给予患者相应个性化治疗及干预方案。