申昌梅 廖振蓉余瑛

（江西省赣州市肿瘤医院， 江西 赣州341000）

宫颈癌是危害女性健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率高［1］，主要危险因素包括高危人类乳头瘤病毒（hrHPV）感染、年龄、吸烟、分娩、使用口服避孕药和饮食，其中hrHPV 持续感染是宫颈癌发展的主要因素，在早期阶段，hrHPV 相关的宫颈癌并无症状［2］。尽管在过去的几十年中，宫颈癌的预防和治疗策略得到了迅速发展，但是晚期和复发性宫颈癌患者的预后生存率仍然很低，其1年生存率仅为10%～20%［3］。化学疗法已被广泛应用于宫颈癌的临床治疗［4］，顺铂是最常见的化学治疗药物，大多数宫颈癌患者在早期可以通过顺铂化疗获得良好的疗效，但在治疗过程中会逐渐产生耐药性，是宫颈癌长期治疗的主要限制［5］。

槲皮素是石斛中的一种主要类黄酮，具有治疗癌症、心血管疾病和神经退行性疾病的潜力［6］。Bishayee 等［7］研究发现，槲皮素可以促进宫颈癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。Che 等［8］研究表明，抑制PI3K／Akt 信号通路的活性可以抑制子宫颈癌细胞的增殖和上皮⁃间质转化（EMT），而激活PI3K／Akt 信号通路可以促进宫颈癌细胞的生长并抑制其凋亡［9］。本实验将探究槲皮素对人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa／DDP 顺铂耐药的影响，以及PI3K／Akt 信号通路在其中起到的调控作用。

1 材料和方法

1.1 试剂与药物 槲皮素（纯度≥98%，货号B20527⁃20 mg，上海源叶生物科技有限公司）；顺铂（纯度98.0～102.0%，货号MZ3502⁃100 mg，上海集奇生物科技有限公司）。二甲基亚砜（DMSO，山东伊维化工科技有限公司）；CCK⁃8 试剂盒、PI3K 抗体、p⁃PI3K 抗体、Akt 抗体、p⁃Akt抗体、Survivin 抗体、MMP⁃2 抗体、二抗山羊抗兔IgG（英国Abcam 公司）；TRIzol（货号15596026，美国Invitrogen公司）；转录试剂盒（货号RR047A，日本TaKaRa 公司）；Transwell 染色试剂盒（货号BL710A，北京白鲨易科技有限公司）。

1.2 细胞株 人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa／DDP（货号CL0677），购自湖南丰晖生物科技有限公司，培养于含20%牛血清（FBS）和10%DMSO 的培养基中，胰酶常规消化、传代。

1.3 细胞分组及给药 取对数生长期的HeLa／DDP 细胞，调整细胞密度，接种于96 孔培养板中，在培养箱中培养24 h，将细胞分为对照组（PBS）、顺铂组（10 μmol／L）和槲皮素低、中、高剂量（20、40、80 μmol／L）＋顺铂（10 μmol／L）组，给予相应剂量药物干预处理。

1.4 CCK⁃8 法检测细胞增殖情况 取对数生长期HeLa／DDP 细胞，调整密度为1×105／mL，并以每孔100 μL 体积接种到96 孔板中，常规培养过夜，按“1.3”项下分组处理，分别在24、48、72 h 时加入10 μL CCK⁃8 检测液，放入培养箱中继续孵育4 h，通过酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度值，以吸光度值表示细胞活力。

1.5 克隆形成实验 取对数生长期HeLa／DDP 细胞，制备成单细胞悬液并计数，每皿中接种1 000 个细胞，于CO2培养箱内培养，每3 d 换液1次，14 d后，弃去培养基，PBS 清洗3次，甲醇固定15 min，结晶紫染色15 min，于显微镜下计数大于50 个细胞的集落数。

1.6 Transwell 实验检测细胞迁移能力 对数生长期HeLa／DDP 细胞饥饿24 h，次日消化细胞，离心后重悬，调整细胞密度为3×105／mL，取0.2 mL 悬液加入Transwell 上室，下室加入700 μL 含10%FBS 的预冷DMEM 细胞培养液，置于5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养，24 h 后湿棉签拭去上室及基底膜上的细胞，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染液染色20 min，流水冲洗，倒置，自然晾干，于倒置显微镜下观察并拍照。

1.7 RT⁃qPCR 法检测细胞PI3K、Akt、Survivin、MMP⁃2 mRNA 表达 收集各组细胞，TRIzol 法提取总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA，20 μL 体系，反应条件为37 ℃15 min，85 ℃5 s。使用SYBR Premix EX Taq试剂盒配置上样体系，通过实时荧光定量PCR 仪进行RT⁃qPCR 反应，反应体系为SYBR Mix 9 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 2 μL、RNase Free dH2O 8 μL。记录各孔CT值，以β⁃actin为内参，采 用2－ΔΔCT法计算PI3K、Akt、Survivin、MMP⁃2 mRNA 相对表达量。

1.8 Western blot 法检测细胞PI3K、p⁃PI3K、Akt、p⁃Akt、Survivin、MMP⁃2 蛋白表达 收集各组细胞，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，提取得到的总蛋白采用BCA 定量试剂盒进行定量，加入上样缓冲液于95 ℃煮沸10 min 进行变性。蛋白样本SDS⁃PAGE 电泳后转移至NC膜，封闭液封闭60 min，加入PI3K、p⁃PI3K、Akt、p⁃Akt、Survivin、MMP⁃2 抗体，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，加辣根过氧化酶标记的二抗山羊抗兔IgG H＆L（HRP），室温下杂交2 h，TBST 洗膜3次，ECL 试剂盒进行发光反应，曝光拍照，并进行图像分析，实验重复3 次。

1.9 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，服从正态分布，多组间比较采用方差分析，2 组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素联合顺铂对HeLa／DDP 细胞增殖能力的影响与对照组比较，48、72 h 各药物处理组细胞增殖能力降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，槲皮素联合顺铂处理组细胞增殖能力降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05），见表1。

表1 各组细胞增殖情况（，n＝3）

表1 各组细胞增殖情况（，n＝3）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与顺铂组比较，＃P＜0.05；与槲皮素低剂量＋顺铂组比较，＄P＜0.05；与槲皮素中剂量＋顺铂组比较，＆P＜0.05。

2.2 槲皮素联合顺铂对HeLa／DDP 细胞克隆形成能力的影响 与对照组比较，各药物处理组细胞克隆形成能力降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，槲皮素联合顺铂处理组细胞克隆形成能力降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05），见表2、图1。

图1 各组细胞克隆形成能力

表2 各组细胞菌落形成率比较（，n＝3）

表2 各组细胞菌落形成率比较（，n＝3）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与顺铂组比较，＃P＜0.05；与槲皮素低剂量＋顺铂组比较，＄P＜0.05；与槲皮素中剂量＋顺铂组比较，＆P＜0.05。

2.3 槲皮素联合顺铂对HeLa／DDP 细胞迁移能力的影响与对照组比较，各药物处理组细胞迁移能力降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，槲皮素联合顺铂处理组细胞迁移能力降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05），见表3、图2。

图2 各组细胞迁移能力（×200）

表3 各组细胞迁移率比较（，n＝3）

表3 各组细胞迁移率比较（，n＝3）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与顺铂组比较，＃P＜0.05；与槲皮素低剂量＋顺铂组比较，＄P＜0.05；与槲皮素中剂量＋顺铂组比较，＆P＜0.05。

2.4 槲皮素联合顺铂对HeLa／DDP 细胞PI3K、Akt、Survivin、MMP⁃2 mRNA 表达的影响 与对照组比较，各药物处理组细胞PI3K、Akt、Survivin、MMP⁃2 mRNA 表达降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，槲皮素联合顺铂处理组细胞PI3K、Akt、Survivin、MMP⁃2 mRNA 表达降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05），见图3。

图3 各组细胞PI3K、 Akt、 Survivin、 MMP⁃2 mRNA 表达比较（，n＝3）

2.5 槲皮素联合顺铂对HeLa／DDP 细胞PI3K／Akt 信号通路活性的影响 与对照组比较，各药物处理组细胞PI3K、p⁃PI3K、Akt、p⁃Akt、Survivin、MMP⁃2 蛋白表达降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，槲皮素联合顺铂处理组细胞PI3K、p⁃PI3K、Akt、p⁃Akt、Survivin、MMP⁃2 蛋白表达降低，并呈剂量依赖性（P＜0.05），见图4。提示，槲皮素联合顺铂可以降低PI3K／Akt 信号通路活性。

图4 各组细胞PI3K、p⁃PI3K、Akt、p⁃Akt、Survivin、MMP⁃2 蛋白表达比较（，n＝3）

3 讨论

宫颈癌的死亡率位居全球癌症死亡率第4，全球新发病例数为52.8 万［10］，我国宫颈癌的发生率与死亡率呈现上升趋势［11］。顺铂是最常用的化学治疗药物，已被证明是治疗晚期或复发性宫颈癌的最有效药物之一［12］，然而顺铂耐药性仍是长期疗效的最大挑战，宫颈癌中对顺铂耐药的机制尚不清楚。

槲皮素是植物界分布广泛，具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，已被证明有抗氧化、抗炎和抗增殖作用，具有潜在的抗癌特性［13］。有大量研究表明，槲皮素在肿瘤治疗方面有一定的效果。在前列腺癌中，槲皮素可以下调hnRNPA1、AR⁃V7 表达，拮抗雄激素受体信号传导，并使enzalutamide 治疗小鼠异种移植重新敏感［14］；在宫颈癌中，槲皮素通过依赖p53 的机制，调控核形态，磷脂酰丝氨酸外化，线粒体膜去极化，调节细胞周期调控蛋白，NF⁃过依家族成员和促凋亡的Bcl⁃2 家族蛋白，诱导G2／M 期细胞周期停滞和线粒体凋亡，以剂量依赖的方式抑制了宫颈癌细胞的活力［15］。槲皮素能够减少细胞内活性氧和脂质过氧化的产生，维持了线粒体膜电位和DNA 的完整性［16］，并以剂量依赖性方式调节各种染色质修饰剂的表达，并降低DNA 甲基转移酶（DNMT），组蛋白脱乙酰基酶（HDAC），组蛋白甲基转移酶（HMT）的活性，从而抑制肿瘤的进一步发生［17］。

PI3K／Akt 通路在调控各种细胞功能（包括代谢、生长、增殖、存活、转录以及蛋白质合成）方面发挥重要作用，在肿瘤调控中同样扮演着重要角色。在前列腺癌中，PI3K／Akt 通路被激活，可促进肿瘤形成、疾病进展和治疗耐药性［18］，PI3K／Akt／mTOR 通路在宫颈癌中经常失调，表明它可能是治疗这种恶性肿瘤的潜在靶标［19］。人乳头瘤病毒（HPV）诱发的宫颈癌中，PI3K／Akt／mTOR 在常氧和低氧HPV 阳性癌细胞中对病毒／宿主细胞串扰起关键作用［20］。

本研究结果发现，槲皮素联合顺铂处理能降低增殖能力、克隆形成能力、迁移能力及PI3K、Akt、Survivin、MMP⁃2 mRNA 和蛋白表达，并呈剂量依赖性。提示，槲皮素可能通过调控PI3K／Akt 信号通路增强顺铂对人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa／DDP 的抗癌作用，为宫颈癌顺铂耐药的研究提供了新的思路。