朱 君 付立霞 支青刘雄利陈琳田民义王慧娟∗

（1.贵州大学生命科学学院／农业生物工程研究院， 山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室，山地生态与农业生物工程协同创新中心， 贵州 贵阳550025； 2.贵州大学西南药食两用资源开发利用技术国家地方联合工程研究中心， 贵州 贵阳550025； 3.贵州大学酿酒与食品工程学院， 贵州 贵阳550025）

炎症是宿主系统受病原体、损伤细胞或其它异物等刺激时所产生的一系列保护性免疫应答，是抵抗自然感染和恢复体内稳态的天然手段。炎症是由各种炎症细胞因子和介质触发的，这些炎症因子从诸如巨噬细胞等促炎细胞中释放出来［1⁃2］。在正常情况下，炎症对于机体的生理功能是有益的，但过度和持续的炎症反应会导致机体受到损害，如降低其对组织损伤、感染或疫苗接种等信号的感知和反应能力，导致先天免疫反应失调［3⁃4］。临床抗炎药物主要分为甾体抗炎药和非甾体抗炎药，具有较多不良反应，长期大量使用会对胃肠道、肝脏、泌尿系统、神经系统等造成损害［5］，因此，从天然药物中寻找新的抗炎药物有重要的意义。

桑科植物桑的干燥嫩枝入药为桑枝，始载于《神农本草经》［6］，具有祛风湿、利关节的功效。现代研究表明，桑枝化学成分种类多样，包括黄酮、生物碱和香豆素等，具有抗炎、降血糖、抗氧化和抑菌等药理活性［7⁃8］。目前，关于桑枝乙醇提取物的抗炎活性及作用机制少有报道。本研究采用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7 细胞的体外炎症模型，并基于核转录因子⁃κB（nuclear factor⁃κB，NF⁃κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinases，MAPKs）信号通路探究桑枝乙醇提取物的抗炎作用机制。

1 材料

1.1 细胞株 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 细胞株，购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。

1.2 试剂与药物 桑枝饮片（产地安徽，批号200706），购自贵州同济堂中药饮片有限公司。芦丁对照品（批号100080⁃202012，含量92.2%），购自中国食品药品检定研究院；噻唑蓝（MTT，批 号 715F0510）、LPS（批号818ED35）、地塞米松（批号320E051），购自北京索莱宝科技有限公司；高糖DMEM 培养基（批号8121551），购自美国Gibco 公司；胎牛血清（批号21090705），购自浙江天杭生物科技股份有限公司；一氧化氮（NO）检测试剂盒（批号120320210430）、BCA 总蛋白定量试剂盒（批号112720201223）、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（批号041521210820）、活性氧（ROS）检测试剂盒（批号112420201215），购自上海碧云天生物技术有限公司；IL⁃6 ELISA 试剂盒（批号A20611035）、TNF⁃α ELISA 试剂盒（批号A28210852），购自杭州联科生物技术股份有限公司；兔抗小鼠抗体 GAPDH（批号 2118S）、iNOS（批号13220S）、COX2（批号12282S）、P65（批号8242S）、p⁃IKBα（批号2859S）、IKBα（批号4812S）、p38（批号9212S）、p⁃p38（批号9211S）、JNK（批号9252S）、p⁃JNK（批号 9251S）、ERK（批号 4695T）、p⁃ERK（批号4370T），购自美国Cell Signaling Technology 公司；兔抗小鼠PARP（批号AB32138），购自英国Abcam 公司；山羊抗兔二抗（批号ABS20002），购自爱必信（上海）生物科技有限公司；Total RNA Kit（批号R6834010002），购自美国BioTek 公司；RT Easy（批号210401）和Real Time PCR Easy SYBR GREEN（批号P210501），购自成都福际生物技术有限公司。

1.3 仪器 RE⁃2000A 型旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；W⁃5200 型紫外可见分光光度计，购自上海元析仪器有限公司；Varioskan LUX 型多功能酶标仪、3111 型CO2恒温恒湿培养箱，购自美国Thermo Fisher Scientifie 公司；DMi8 型倒置荧光相差显微镜，购自德国徕卡公司；XPE205 型十万分之一电子天平，购自瑞士Mettler Toledo公司；ChemiDocTMTouch Imaging System 型V3 蛋白免疫印迹系统、CFX ConnectTMReal⁃Time System 型三通道梯度荧光定量PCR 分析仪，购自美国Bio⁃Rad 公司。

2 方法

2.1 桑枝乙醇提取物的制备 取适量桑枝饮片粉碎，加10 倍量70%乙醇回流提取，提取2次，每次1.5 h，合并提取液，抽滤，减压浓缩，冷冻干燥后得到干燥粉末，提取率为6.60%。

2.2 桑枝乙醇提取物中总黄酮含量检测

2.2.1 标准曲线的绘制 精密称定芦丁对照品15.32 mg，置50 mL 量瓶中，加适量70%乙醇超声处理使之溶解，放冷，70%乙醇定容至刻度，摇匀备用。精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分别置于25 mL 量瓶中，各加蒸馏水至6 mL，加5% 亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，采用紫外可见分光光度计于500 nm 波长处检测吸光度值。以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

2.2.2 样品检测 称取桑枝乙醇提取物125 mg，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，70% 乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2 mL，置25 mL 量瓶中，按“2.2.1”项下标准曲线的制备方法，自“加蒸馏水至6 mL”起，依法检测吸光度，同时精密量取续滤液2 mL，置25 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。通过标准曲线计算供试品溶液中芦丁的含量，并计算样品中总黄酮的含量。

2.3 细胞培养 RAW264.7 细胞采用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培养基（加100 μg／mL 双抗和2 mmol／L 谷氨酰胺），于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2.4 MTT 法检测细胞活性 将处于对数生长期的RAW264.7 细胞接种于96 孔板，密度为6.25×104／mL，随机分为对照组和实验组，分别设置3 个复孔，实验组细胞接种24 h 后加入不同质量浓度桑枝乙醇提取物（3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1 000 μg／mL）继续培养24 h，然后加入10 μL 5 mg／mL MTT，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡后于490 nm波长处检测吸光度值，计算细胞存活率。

2.5 细胞上清液NO、IL⁃6、TNF⁃α 水平检测 将处于对数生长期的RAW264.7 细胞接种于96 孔板，密度为6.25×104／mL，随机分为对照组、模型组、阳性组和桑枝乙醇提取物组，分别设置3 个复孔，细胞接种24 h后，对照组换用DMEM 高糖培养基；模型组换用含LPS（1 μg／mL）的DMEM 高糖培养基；阳性组换用含LPS（1 μg／mL）＋地塞米松（20 μg／mL）的DMEM 高糖培养基；桑枝乙醇提取物组换用含LPS（1 μg／mL）＋桑枝乙醇提取物（40、80、160 μg／mL）的DMEM 高糖培养基，继续培养24 h，吸取各组上清培养基，按照NO 检测试剂盒说明书采用Griess 法检测各组细胞上清液NO 水平，按照相应ELISA 试剂盒说明书检测各组细胞上清液IL⁃6、TNF⁃α水平。

2.6 DCFH⁃DA 荧光探针法检测细胞中ROS 水平 将处于对数生长期的RAW264.7 细胞接种于6 孔板，密度为6.25×104／mL，按照“2.5”项下方法分组培养24 h后，弃培养基，PBS 润洗2次，每孔加1 mL 稀释液（用无血清DMEM高糖培养基按1∶1 000 比例稀释DCFA⁃DA），于培养箱内孵育20 min，用无血清DMEM 高糖培养基洗涤3次，于倒置荧光显微镜下设置激发波长460～500 nm，发射波长512～542 nm 进行荧光拍摄。拍摄完成后，加胰酶消化，每孔加入900 μL PBS 制成细胞悬液，取200 μL 加入96 孔板（每组3 个复孔），避光静置30 min，在激发波长488 nm，发射波长525 nm 条件下检测荧光强度。

2.7 RT⁃qPCR 法检测细胞相关炎症因子mRNA 表达 将处于对数生长期的RAW264.7 细胞接种于6 孔板，密度为6.25×104／mL，按照“2.5”项下方法分组培养24 h后，收集细胞，按照Total RNA Kit 试剂盒说明书提取总RNA。反应体系按照Real Time PCR Easy SYBR GREEN 试剂盒说明书配制，反应条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共循环40 次。以β⁃actin为内参，采用2－ΔΔCT法计算相关基因mRNA 表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.8 Western blot 法检测炎症相关通路蛋白表达 将处于对数生长期的RAW264.7 细胞接种于6 孔板，密度为6.25×104／mL，按照“2.5”项下方法分组培养24 h后，收集细胞，采用RIPA 裂解液（含1% 蛋白酶抑制剂）提取总蛋白，再按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒进行胞浆蛋白和核蛋白的提取，采用BCA 总蛋白定量试剂盒检测各样品中蛋白浓度。蛋白先进行SDS⁃PAGE 凝胶电泳，再将目的蛋白转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶封闭1 h，TBST洗膜，加一抗4 ℃孵育过夜，次日TBST 洗膜，加二抗（羊抗兔）孵育1 h，ECL 法显色，并于显影仪上显影曝光。

2.9 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理，数据以（）表示，多组间比较应用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 桑枝乙醇提取物中总黄酮的含量 如图1 所示，芦丁对照品溶液在11.30～67.80 mg／L 范围内线性关系良好，回归方程为A＝0.009 58X－0.023 3（R2＝0.999）。参照芦丁对照品吸光度值计算得桑枝乙醇提取物中总黄酮含量为（8.47±0.12）%。

图1 标准曲线图

3.2 桑枝乙醇提取物对RAW264.7 细胞存活率的影响 如图2 所示，与对照组比较，桑枝乙醇提取物在3.9～250 μg／mL 质量浓度范围内对RAW264.7 细胞存活率无明显影响（P＞0.05），500、1 000 μg／mL 桑枝乙醇提取物组细胞存活率降低（P＜0.01）。因此，本研究选择40、80、160 μg／mL 质量浓度进行后续实验。

图2 桑枝乙醇提取物对RAW264.7细胞存活率的影响（，n＝3）

3.3 桑枝乙醇提取物对LPS 诱导RAW264.7 细胞上清液NO、TNF⁃α、IL⁃6 水平的影响 如图3 所示，与对照组比较，模型组细胞上清液中NO、TNF⁃α、IL⁃6 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，桑枝乙醇提取物组可以抑制RAW264.7 细胞NO、TNF⁃α、IL⁃6 的释放（P＜0.05，P＜0.01）。提示，桑枝乙醇提取物对LPS 诱导的炎症因子水平升高具有抑制作用，表现出较好的剂量依赖性。

图3 桑枝乙醇提取物对RAW264.7 细胞上清液NO、TNF⁃α、IL⁃6 水平的影响（，n＝3）

3.4 桑枝乙醇提取物对LPS 诱导RAW264.7 细胞ROS 水平的影响 炎症反应的发生伴随着氧化应激，当机体发生氧化应激会产生大量的ROS 并抑制氧自由基清除剂SOD 等酶的活性，最终导致细胞的氧化损伤［9］。如图4 所示，与对照组比较，模型组RAW264.7 细胞在LPS 的刺激下，ROS 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，桑枝乙醇提取物干预后，细胞ROS 水平降低（P＜0.01），表明桑枝乙醇提取物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞ROS 水平上调具有抑制作用。

图4 桑枝乙醇提取物对RAW264.7 细胞ROS 水平的影响（，n＝3）

3.5 桑枝乙醇提取物对LPS 诱导RAW264.7 细胞炎症因子及M1／M2 型标志物mRNA 表达的影响 如图5 所示，对照组RAW264.7 细胞呈圆形；模型组细胞主要为梭形；而桑枝乙醇提取物组细胞随着干预剂量的增加，梭形和不规则细胞逐渐减少，圆形细胞增多。如图6 所示，与对照组比较，模型组细胞COX⁃2、iNOS、TNF⁃α、IL⁃6 mRNA 表达升高（P＜0.01），Arg⁃1、IL⁃10 mRNA 表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，桑枝乙醇提取物组细胞COX⁃2、iNOS、TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1βmRNA 表达降低（P＜0.01），Arg⁃1、IL⁃10 mRNA 表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。提示，桑枝乙醇提取物可以降低LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症因子mRNA 表达，并且可以调控LPS 引起的RAW264.7 细胞由M1 型（标志物iNOS、TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β）向M2 型（标志物Arg⁃1、IL⁃10）的转化。

图5 各组RAW264.7 细胞的形态学变化

图6 桑枝乙醇提取物对RAW264.7 细胞炎症因子及M1／M2 型标志物mRNA 表达的影响（，n＝3）

3.6 桑枝乙醇提取物对LPS 诱导RAW264.7 细胞iNOS、COX⁃2 蛋白及NF⁃κB、MAPKs 信号通路相关蛋白表达的影响 如图7 所示，与对照组比较，模型组细胞iNOS、COX⁃2 蛋白、细胞核P65／胞浆P65 蛋白比值及IKBα、p38、JNK、ERK 蛋白磷酸化表达均升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，桑枝乙醇提取物干预后，细胞iNOS、COX⁃2 蛋白、细胞核P65／胞浆P65 蛋白比值及IKBα、p38、JNK、ERK 蛋白磷酸化表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示，桑枝乙醇提取物可能通过调节NF⁃κB 和MAPKs 这2 条信号通路的蛋白表达来发挥抗炎作用。

图7 桑枝乙醇提取物对RAW264.7 细胞iNOS、COX⁃2 蛋白及NF⁃κB、MAPKs 信号通路相关蛋白表达的影响（，n＝3）

4 讨论

脂多糖是在革兰氏阴性细菌细胞壁中发现的细菌内毒素，已被广泛用于体内和体外引起各种免疫细胞的免疫应答，包括巨噬细胞的活化［10］。RAW264.7 小鼠巨噬细胞是巨噬细胞的一种，常用作体外炎症模型［11］。受LPS 激活的RAW264.7 细胞会产生大量的炎性因子，引起炎症反应和组织损伤。其中，iNOS 作为一种前促炎因子，在体内可以催化L⁃Arg 产生NO，而NO 在高水平状态下，可以诱导TNF⁃α、IL⁃6 和IL⁃1β 等促炎因子的产生［12⁃13］。COX⁃2 是合成体内前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的一种限速酶，主要由MAPKs 信号通路中的ERK 入核调控表达，而PGE2在炎症反应中可以促进炎症的发生和作为诱导疼痛的炎性介质［14］。本研究发现，桑枝乙醇提取物可以抑制LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症因子NO、TNF⁃α 和IL⁃6 水平，还能降低LPS 诱导的ROS 水平，提示桑枝乙醇提取物对LPS 诱导的炎症具有抑制作用。

巨噬细胞的表型转化在病理进程中发挥着重要作用，M1 型巨噬细胞主要发挥促炎、吞噬病原体的作用，M2 型巨噬细胞主要发挥促进组织重塑、损伤修复等作用［15⁃16］。本研究发现，桑枝乙醇提取物可以减少LPS 诱导的梭形和不规则RAW264.7 细胞形态，下调由LPS 诱导的M1 型标志物，同时促进M2 型标志物的表达。上述结果提示，桑枝乙醇提取物能抑制LPS 诱导的巨噬细胞向M1 型分化表达，促进巨噬细胞向M2 型分化。

CD14 是一种在髓样细胞表面上发现的相对分子量为53 kDa的糖蛋白［17］。作为LPS 受体，它具有识别LPS 并能与之结合，介导LPS 诱导的细胞信息反应。CD14 可以向受体复合物MD⁃2／TLR4 发出信号以呈递LPS，并进一步激活NF⁃κB 和MAPKs 信号通路［18⁃19］。NF⁃κB 通常以P65⁃P50 这种异二聚体的形式存在于细胞质。当细胞处于静息状态时，NF⁃κB 在细胞质与抑制物IKBα 结合，处于非活化状态；当细胞受到外界信号刺激，IKBα 被磷酸化降解，并将P65 转位入核与DNA 结合，促进炎症因子IL⁃6、TNF⁃α 等大量表达［20⁃21］。本研究发现，桑枝乙醇提取物可减少P65 蛋白抑制物IKBα 磷酸化，同时降低转运入细胞核P65 蛋白表达。MAPKs 是真核细胞内一类家族蛋白的统称，其信号通路的活化，与ERK、JNK 和p38 的级联激活有关，被活化的MAPK 信号通路从细胞表面传递到细胞核，促进了炎症因子的表达，并触发多种生理反应［22］。本研究发现，桑枝乙醇提取物可以下调p38、JNK 和ERK 蛋白的磷酸化。

综上所述，桑枝乙醇提取物能够较好地抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症反应，其分子机制可能与抑制NF⁃κB 和MAPKs 信号通路有关。