穆阿宁 梁引库 李云祥刘旭

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院， 陕西 汉中723000； 2.陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中723000）

阴道炎是一种常见的阴道黏膜、黏膜结缔组织发炎的疾病，也是患病率较高的妇科疾病之一，易引起宫颈炎，严重时会感染盆腔、上生殖道、腹腔［1］。治疗阴道炎的抗生素较多，如硝基咪唑类、氟喹诺酮类等治疗细菌性阴道炎［2］，咪唑类、三唑类等治疗念珠性阴道炎，甲硝唑、替硝唑、硝基咪唑类治疗滴虫性阴道炎［3］，虽然见效快，时间短，但也存在一定局限性［4］，易产生耐药性，导致病情反复发作，困扰患者正常生活［5］。

随着社会发展，人们面临病菌威胁的形势越来越严峻，加上其自身变异后会产生耐药性，导致现有抗生素逐渐失去原有效果［6］。研究表明，病菌耐药性、抗药性主要体现在对某一种或几种抗菌药物的耐药作用，但是当多种药物联合作用时则能有效抑制其生长［7］，故多重抗菌药物正成为现今研究的热点内容，其中中药复方制剂是主要方向。因此，本实验筛选治疗阴道炎的中药方剂，并进行优化，以期为开发相关制剂提供依据。

1 材料

1.1 药材 蒲公英、五倍子、苦参、黄连、夏枯草、黄芩均购自陕西省汉中市陕西美致惠健康大药房连锁有限公司，经陕西理工大学李新生教授鉴定为正品。

1.2 菌株 金黄色葡萄球菌（批号ATCC25925）、白色念珠菌（批号ATCC10231）、加德纳杆菌（批号ATCC14018），由陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室提供，置于－80 ℃低温冰箱中冷冻保存，实验前复苏传代。

1.3 试剂与药物 琼脂粉、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠购自天津市盛奥化学试剂有限公司；石油醚购自天津市光复科技发展有限公司；无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚购自天津市富宇精细化工有限公司；二甲基亚砜购自天津市博迪化工有限公司；无菌辅酶I、HTM 基础培养基购自上海瑞楚生物科技有限公司；7 mm 无菌纸片为自制。

1.4 仪器 HC⁃250 型摇摆式粉碎机购自永康市天祺盛世工贸有限公司；DHG⁃9203A 型真空干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司；2XZ 型旋片式真空泵购自临海市谭氏真空设备有限公司；HH⁃S4 型电热恒温水浴锅购自北京科伟永兴仪器有限公司；FA2204B 型电子天平购自上海精密科学仪器有限公司；UV2550 型分光光度计购自日本岛津公司；DHP⁃9162 型电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；SW⁃CJ⁃1D 型单人超净工作台购自上海苏净实业有限公司。

2 方法与结果

2.1 文献检索与分析 在CNKI 数据库中以“白色念珠菌”“加德纳杆菌”“金黄色葡萄球菌”为研究对象，“中药”“需氧细菌性阴道炎”“细菌性阴道炎”“霉菌性阴道炎”为关键词，初步筛选具有抗菌作用的中药，作为中药方剂候选复方组分。结果，对阴道炎有抑制作用的中药有123种，并且活性成分种类很多，包括生物碱、黄酮、苯丙素、挥发油等［8］，其中对白色念珠菌、加德纳杆菌、金黄色葡萄球菌有效果者见表1［9⁃23］。

表1 对阴道炎相关致病菌有抑制作用的中药

由此可知，黄芩对白色念珠菌的抑制效果优于其他中药；苦参、黄芩对加德纳杆菌表现为高敏感性；夏枯草、五倍子、黄连抑制金黄色葡萄球菌生长能力最强。前期研究发现，蒲公英所含酚类成分对白色念珠菌、加德纳杆菌的抑制作用较强，其机制与破坏两者生物膜有关［24］。因此，初步将蒲公英、黄芩、苦参、夏枯草、五倍子、黄连作为中药方剂候选组分。

2.2 提取物制备 将“2.1”项下6 种中药方剂候选组分在70 ℃下干燥至恒重，粉碎机粉碎后过60 目筛，称取适量粉末，按照比例分别加入水、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚进行提取，即得，置于60 ℃真空干燥箱中挥尽水分得到浸膏，在4 ℃下保存。

2.3 中药方剂组分筛选 采用纸片抑菌法考察“2.2”项下提取物（质量浓度均为100 mg／mL）对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、加德纳杆菌的抑制作用，测定抑菌圈直径，空白对照组纸片滴加相应药物溶剂［8］，结果见表2～4。

表2 提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用

由此可知，黄连醇提物对白色念珠菌的抑制能力最强，对金黄色葡萄球菌也有较强作用；五倍子水提物对金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌的抑制能力较强；苦参乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌的抑制能力最强；蒲公英乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌的抑制能力较强；黄芩水提物、醇提物、乙酸乙酯提取物及夏枯草水提物、醇提物对3 种致病菌均有一定抑制能力，但均不突出。综上所述，黄连醇提物、五倍子水提物、苦参乙酸乙酯提取物、蒲公英乙酸乙酯提取物具有良好的抑菌作用。

表4 提取物对加德纳杆菌的抑制作用

2.4 最小抑菌浓度测定 将活化好的3 种致病菌调至最佳吸光度作为指示菌，其中金黄色葡萄球菌接种于LB 液体培养基，白色念珠菌接种于沙氏液体培养基，加德纳杆菌接种于HTM 液体培养基，再配制256 mg／mL 提取物母液，接入5%调好浓度的菌悬液，37 ℃、200 r／min 培养24 h。设置对照组质量浓度0 mg／mL，以药物组试管内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最小抑菌浓度（MIC）。另外，由于中药颜色和提取物浑浊度的影响，故采用无菌接种环充分蘸取对应管中液体，转涂于相应培养基时后，在37 ℃下过夜培养12 h，划线处无细菌生长时确定为MIC。

采用倍比稀释法［25］测定“2.3”项下4 种提取物对致病菌的MIC，结果见表5。由此可知，黄连醇提物对白色念珠菌的抑制能力最强；苦参乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、加德纳菌的抑制能力最强；蒲公英乙酸乙酯提取物对3 种致病菌均有一定抑制能力，但均不突出；五倍子水提物对白色念珠菌的抑制能力较弱。

表5 提取物对致病菌的MIC

2.5 正交试验 选择“2.4”项下抑菌效果显著（MIC 较低）的提取物，按照正交表L9（34）配成中药方剂，以蒲公英乙酸乙酯提取物质量浓度（A）、五倍子水提物质量浓度（B）、苦参乙酸乙酯提取物质量浓度（C）、黄连醇提物质量浓度（D）为影响因素，课题组前期研究发现，加入0.25、0.5、0.75 倍MIC 蒲公英提取物后，加德纳杆菌细胞膜遭到破坏，细胞通透性增强［8］，故每个因素设置3个水平，分别为1、0.5、0.25 倍MIC，并以抑菌圈直径（Y）为评价指标，采用正交试验［26］优化配方。

2.5.1 加德纳杆菌 因素水平见表6，结果见表7，可知各因素影响程度依次为C＞A＞B＞D。方差分析见表8，可知因素A、B、C有显著影响（P＜0.01），而D无显著影响（P＞0.05）。最终确定，最优配方为A3B2C1D2，即8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 五倍子水提物、16 mg／mL苦参乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黄连醇提物（四者质量浓度比例为1∶2∶2∶2）。

表6 对加德纳杆菌抑制作用的因素水平

表7 对加德纳杆菌抑制作用的试验设计与结果

表8 对加德纳杆菌抑制作用的方差分析

2.5.2 金黄色葡萄球菌 因素水平见表9，结果见表10，可知各因素影响程度依次为D＞B＞C＞A。方差分析见表11，可知各因素均有显著影响（P＜0.01）。最终确定，最优配方为A1B1C1D3，即16 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、16 mg／mL五倍子水提物、2 mg／mL 苦参乙酸乙酯提取物、4 mg／mL 黄连醇提物（四者质量浓度比例为8∶8∶1∶2）。

表9 对金黄色葡萄球菌抑制作用的因素水平

表10 对金黄色葡萄球菌抑制作用的试验设计与结果

表11 对金黄色葡萄球菌抑制作用的方差分析

2.5.3 白色念珠菌 因素水平见表12，结果见表13，可知各因素影响程度依次为C＞B＞D＞A。方差分析见表14，可知各因素均有显著影响（P＜0.01）。最终确定，最优配方为A3B2C1D1，即8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、32 mg／mL五倍子水提物、32 mg／mL 苦参乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黄连醇提物（四者质量浓度比例为1∶4∶4∶2）。

表12 对白色念珠菌抑制作用的因素水平

表13 对白色念珠菌抑制作用的试验设计与结果

表14 对白色念珠菌抑制作用的方差分析

2.6 抑菌作用筛选 分别将“2.5.1”“2.5.2”“2.5.3”项下优化配方命名为配方1、配方2、配方3，其抑制效果见图1。再以抑菌圈直径为指标，将抑菌能力最弱的配方2分别与配方1、配方3 进行组间方差分析，结果见图2。

图1 各配方对致病菌的抑制效果

图2 各配方抑菌圈直径

由此可知，指示菌为金黄色葡萄球菌时，与配方2 比较，配方1 抑菌圈直径无显著差异（P＞0.05），表明两者抑菌作用相当；配方3 抑菌圈直径增大（P＜0.01），达14.67 mm，表明其抑菌作用最强。指示菌为加德纳杆菌时，与配方2 比较，配方1、配方3 抑菌圈直径无显著差异（P＞0.05），表明三者抑菌作用相当。指示菌为白色念珠菌时，与配方2 比较，配方1 抑菌圈直径无显著差异（P＞0.05），表明两者抑菌作用相当；配方3 抑菌圈直径增大（P＜0.05），表明其抑菌作用最强。综上所述，配方3 为治疗阴道炎的最佳中药方剂。

3 讨论与结论

阴道炎按疾病起因分类，需氧性细菌阴道炎、厌氧性细菌阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎占据总数的90%，其中需氧性细菌阴道炎主要由需氧性细菌引起，常见的有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链霉菌等；厌氧性细菌阴道炎在成年女性中最容易发生，主要由厌氧性细菌引起，乳酸杆菌菌群减少或缺失导致阴道pH 值上升，引起加德纳菌属大量繁殖，进而导致阴道黏膜发生炎症；霉菌性阴道炎主要由假丝酵母菌引起，其中白色念珠菌是最主要的感染细菌，其感染阴道时可引起外阴、阴道瘙痒，近年来抗生素大量使用导致阴道内环境酸碱度上调，为该病菌增殖提供了条件，进而导致阴道疾病反复发作。因此，本实验选取金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌、白色念珠菌作为病原菌，筛选治疗阴道炎的中药方剂。

在前期蒲公英提取物研究的基础上，本实验通过文献调研筛选出6 味中药，分别为黄连、五倍子、黄芩、夏枯草、苦参、蒲公英，通过纸片抑菌法确定蒲公英乙酸乙酯提取物、五倍子水提物、苦参乙酸乙酯提取物、黄连醇提物对金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌、白色念珠菌具有良好的抑制效果，其中黄连醇提物抑制白色念珠菌的作用显著优于其他三者，蒲公英、苦参乙酸乙酯提取物及五倍子水提物对加德纳菌的抑制能力显著高于黄连醇提物。采用正交试验优化配方，得到配方1～3，对抑制上述3 种致病菌各有优势，其中配方3 效果最突出，其组成为8 mg／mL 蒲公英乙酸乙酯提取物、32 mg／mL 五倍子水提物、32 mg／mL苦参乙酸乙酯提取物、16 mg／mL 黄连醇提物（即四者质量浓度比例为1∶4∶4∶2），它通过不同中药之间的复配关系来增强药效，以达到安全、低毒、经济的目的，可为开发新型治疗阴道炎的药物提供思路。