孙 兰 李家春王燕 皇立卫王丽 王振中

（1.江苏食品药品职业技术学院， 江苏 淮安223003； 2.江苏财经职业技术学院， 江苏 淮安223003；3.江苏省原子医学研究所， 江苏 无锡214063； 4.江苏康缘药业股份有限公司， 中药制药过程新技术国家重点实验室， 江苏 连云港222001）

盆腔炎性疾病是女性多发性疾病，主要由腹膜、子宫、卵巢等发生感染时所引起的炎症总称［1］。由于定位不准确，疾病播散不局限于一个器官，盆腔炎症疾病很难诊断，延误诊治可能导致慢性盆腔痛、输卵管卵巢脓肿、不孕症等永久性后遗症［2］。除了常规临床和实验室检查外，超声检查、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等成像技术也用以诊断盆腔炎症疾病［3］。正电子发射断层扫描术（positron emission tomography，PET）在肿瘤学、心脏病学和神经病学中的广泛应用使其受到越来越多的关注［4⁃5］。18F⁃2⁃氟⁃2⁃脱氧⁃D⁃葡萄糖（18F⁃FDG）作为葡萄糖同系物，是MicroPET 诊断和治疗癌症、神经疾病的标准放射性药物［6⁃8］。基于活化的炎性细胞对葡萄糖的摄取增加，18F⁃FDG 被开发为炎症疾病显影的显像剂［9］。

桂枝茯苓胶囊由桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍和桃仁5 种药材组成，处方源于《金匮要略》桂枝茯苓丸，具有活血化瘀、缓消癥块的功效，主要用于盆腔炎性疾病、原发性痛经和子宫肌瘤等疾病，临床疗效显著［10⁃11］。本实验采用苯酚胶浆复制大鼠盆腔炎模型，采用MicroPET 技术观察炎症子宫对18F⁃FDG 的摄取水平，以此反映桂枝茯苓胶囊对模型大鼠盆腔炎的改善作用，为桂枝茯苓胶囊临床治疗盆腔炎性疾病提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠，雌性，体质量180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017⁃0005。大鼠分笼饲养，饲养温度20～24 ℃，相对湿度40%～70%，自由饮水，实验动物使用许可证号SYXK（苏）2019⁃0025，动物实验已通过江苏省原子医学研究所实验动物伦理委员会的批准（审查号jsinm⁃39）。

1.2 药物 桂枝茯苓胶囊（江苏康缘药业股份有限公司）；妇科千金片（株洲千金药业股份有限公司）。

1.3 试剂 苯酚、乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、K2CO3、NaHCO3、水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；18F⁃FDG 前体（无锡市江原实业技贸有限公司）；注射用水（江苏四环生物股份有限公司）。肿瘤坏血因子α（TNF⁃α）、白细胞介素⁃1β（IL⁃1β）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（美国eBioscience 公司）。

1.4 仪器 医用回旋加速器（Sumitomo HM⁃7型，日立住友重机械建机起重机株式会社）；18F⁃FDG 专用合成模块（PET⁃FDG⁃IT⁃Ⅱ型，北京派特生物技术有限公司）；麻醉机（Matrx VMR型，美国Matrx公司）；MicroPET 扫描仪（Inveon型，德国Simens公司）；γ 计数仪、Cyclone⁃磷屏成像系统（1470型、C431200型，美国Perkin Elmer 公司）；活度计（CURIEMENTOR 3型，德国PTW 公司）；电子天平（AS210型，德国Sartorius 公司）；QMA 柱、C18柱固相萃取小柱（WAT023525 型、Sep⁃Pak型，美国Waters 公司）。

2 方法

2.1 造模及给药 60 只大鼠，参考文献［12］ 报道方法复制大鼠盆腔炎模型。用10% 水合氯醛350 mg／kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部分别用碘伏和75%乙醇消毒，下腹部正中切口约2 cm，暴露子宫，由左侧子宫向卵巢方向缓慢注入15% 苯酚胶浆0.1 mL（液化苯酚5 mL、黄蓍树胶粉1 g、甘油2 mL 制成的混合液中加蒸馏水至33.3 mL，配制15%苯酚胶浆），分层关腹，消毒术区。大鼠随机分为假手术组、模型组、桂枝茯苓胶囊组（0.558 g／kg）和妇科千金片组（1.525 g／kg），其中桂枝茯苓胶囊组、妇科千金片组各12只，假手术、模型组各18 只。造模4 周后开始灌胃给药，桂枝茯苓胶囊组、妇科千金片组给予相应剂量药物，假手术组、模型组给予0.5% CMC⁃Na 混悬液，容量均为10 mL／kg，每天1次，连续给药28 d。

2.2 子宫组织病理形态观察 给药28 d后，脱颈椎处死动物，各组大鼠子宫组织放射自显影、18F⁃FDG MicroPET 测定结束后，取子宫固定于10%甲醛溶液，脱水，石腊包埋，切片经HE 染色，光学显微镜观察（1）子宫内膜及固有层腺体上皮细胞有无变性坏死，（2）子宫内膜有无充血水肿及炎细胞浸润，（3）子宫肌层有无炎细胞浸润。根据无明显病变、轻度病变、中度病变、重度病变分别记为0 分、1 分、2 分、3分，计算各组平均分值，分值越高表明盆腔炎性病变程度越严重。

2.3 ELISA 法检测血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平 给药第14、28天，各组大鼠脱颈椎处死前，眼眶静脉层采血1.5 mL 于未加抗凝剂EP 管中，3 000 r／min离心15 min，取上层血清，按试剂盒说明书检测IL⁃1β、TNF⁃α 水平。

2.4 放射自显影检测 给药前假手术组、模型组各取6 只大鼠，给药后第14天，各组取6 只大鼠通过尾静脉注射11.1 MBq（0.3 mCi）18F⁃FDG，1 h后脱颈椎处死所有大鼠，取出每只大鼠两侧子宫并固定在显微镜玻片上，分别将解剖后的子宫进行磷屏显像放射自显影，使用OptiQuant 软件对放射自显影图像进行定量，分析18F⁃FDG 摄取情况，计算各组摄取相对值，公式为摄取相对值＝左侧子宫摄取／右侧子宫摄取。

2.5 γ 计数 各组大鼠子宫完成放射自显影检测后，利用γ 计数仪检测每只大鼠两侧子宫γ 计数。

2.618F⁃FDG MicroPET 检测 各组大鼠给药第28天，禁食8 h，用异氟醚麻醉大鼠，并通过插管注射11.1 MBq（0.3 mCi）18F⁃FDG，1 h 后将大鼠俯卧在扫描仪内扫描。在各组大鼠子宫上绘制感兴趣区域（ROI），并计算ROI 中的平均标准摄取值（SUV mean，%ID／g）。

2.7 统计学分析 通过Graphpad Prism5.0 软件进行处理，数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 桂枝茯苓胶囊对盆腔炎大鼠子宫组织病理形态的影响 假手术组子宫组织结构正常；与假手术组比较，模型组大鼠子宫组织病理综合评分升高（P＜0.01），子宫壁有炎性细胞浸润，内膜水肿、充血明显；与模型组比较，桂枝茯苓胶囊组和妇科千金片组大鼠子宫病理综合评分降低（P＜0.01），内膜充血水肿、炎性细胞浸润等病理损伤程度明显减轻，见图1。

图1 桂枝茯苓胶囊对大鼠子宫组织病理形态（A）及综合评分（B）的影响（，n＝6）Fig.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on histopathological morphology（A）and comprehensive scores（B）of rat uterus tissue（，n＝6）

3.2 桂枝茯苓胶囊对盆腔炎大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平升高（P＜0.01）；给药第14、28天，与模型组比较，桂枝茯苓胶囊组和妇科千金片组大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 桂枝茯苓胶囊对大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平的影响（pg／mL，，n＝6）Tab.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat serum IL⁃1β and TNF⁃α levels（pg／mL，，n＝6）

表1 桂枝茯苓胶囊对大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平的影响（pg／mL，，n＝6）Tab.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat serum IL⁃1β and TNF⁃α levels（pg／mL，，n＝6）

注：与假手术组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3.3 桂枝茯苓胶囊对盆腔炎大鼠子宫自显影的影响 如图2 所示，给药前，与假手术组比较，模型组大鼠摄取相对值升高（P＜0.01），表明盆腔炎模型建立成功的。如图3 所示，给药第14天，与模型组比较，桂枝茯苓胶囊组和妇科千金片组大鼠子宫摄取相对值降低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠子宫自显影（A）及摄取相对值（B）（，n＝6）Fig.2 Uterine autoradiography（A）and relative uptake value（B）of rats in each group（，n＝6）

图3 桂枝茯苓胶囊对大鼠子宫自显影的影响（，n＝6）Fig.3 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat uterine autoradiography（，n＝6）

3.4 桂枝茯苓胶囊对盆腔炎大鼠子宫γ 计数的影响 给药前及给药第14天，模型组大鼠左侧子宫每分钟放射性活性高于假手术组（P＜0.01），见图4A。给药第14天，与模型组比较，桂枝茯苓胶囊组和妇科千金片组大鼠左侧子宫每分钟放射性活性降低（P＜0.01），见图4B。

图4 各组大鼠子宫γ 计数比较（，n＝6）Fig.4 Comparison of γ⁃count in rat uterus of each group（，n＝6）

3.5 桂枝茯苓胶囊对盆腔炎大鼠子宫18F⁃FDG MicroPET 扫描的影响 模型组大鼠双侧子宫MicroPET 扫描图像的ROI 分析显示放射性摄取存在显著差异，左侧子宫为（2.672±0.095）%ID／g，而右侧子宫为（1.779±0.486）% ID／g，模型组左侧子宫摄取值高于假手术组（P＜0.01）；与模型组比较，给药28 d后，桂枝茯苓胶囊组和妇科千金片组大鼠左侧子宫放射性摄取值均降低（P＜0.01），见图5。

图5 桂枝茯苓胶囊对大鼠子宫18F⁃FDG MicroPET 扫描的影响（，n＝6）Fig.5 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat uterus revealed by 18F⁃FDG MicroPET scanning（，n＝6）

4 讨论

盆腔炎性疾病主要包括盆腔腹膜炎、子宫内膜炎等，如治疗不彻底，常会引起慢性盆腔痛、输卵管妊娠等并发症，给患者的身心健康带来严重危害［13］。中医认为血瘀是盆腔炎性疾病主要病机，归为“不孕”“妇人腹痛”等范畴［14］。桂枝茯苓胶囊是临床治疗妇科血瘀证的经典方剂，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍组成，具有活血调经、化瘀消癥功能，临床上用于治疗痛经、盆腔炎、子宫肌瘤等疾病［15］。现代药理研究表明，桂枝茯苓胶囊具有抑制子宫平滑肌收缩、抑制炎症因子、调节免疫、改善微循环等作用［16］。为了进一步验证桂枝茯苓胶囊对盆腔炎性疾病抗炎作用，本研究采用苯酚胶浆复制大鼠盆腔炎模型。病理结果表明，模型组大鼠子宫壁有炎性细胞浸润，内膜水肿、充血明显；桂枝茯苓胶囊组大鼠内膜充血水肿、炎性细胞浸润等病理损伤程度明显减轻，子宫病理综合评分降低，结果提示，桂枝茯苓胶囊对盆腔炎模型大鼠具有抗炎作用。

IL⁃1β、TNF⁃α 是主要促炎细胞因子，在炎症早期阶段，体内TNF⁃α 水平升高，激活淋巴细胞、中性粒细胞等向病变部分迁移，进而促进IL⁃1β、IL⁃6 等多种炎性因子的合成释放［17］。IL⁃1β 是体内重要的炎性介质，是促进体内白细胞浸润的主要细胞因子［18］。研究显示，桂枝茯苓胶囊通过降低TNF⁃α、IL⁃2 水平以发挥治疗盆腔炎性疾病的作用［19⁃20］。牡丹皮、白芍中丹皮酚具有镇痛、抗炎作用，可以降低子宫内膜异位症大鼠血清中IL⁃6、IL⁃1β 细胞因子水平［21］；桃仁中苦杏仁苷通过抑制一氧化氮合酶的表达，发挥抗炎作用可有效缓解炎性痛［22］；茯苓中齐墩果酸通过调节MAPK 信号通路抑制巨噬细胞炎性因子的表达［23］。本研究结果显示，模型组大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平升高；桂枝茯苓胶囊干预后，血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平降低，结果提示，桂枝茯苓胶囊能够减轻大鼠盆腔炎症反应，与前述文献报道结果相符。

应用MicroPET 技术评价桂枝茯苓胶囊治疗盆腔炎性疾病的研究较少报道，18F⁃FDG 是MicroPET技术常用的炎症诊断显像剂［24⁃25］。当有炎症反应时，机体炎症细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞等代谢增强，摄取葡萄糖相应增加，通过MicroPET 技术可观察病变部位对葡萄糖的摄取量差异来诊断机体炎症疾病发展的严重程度，摄取值越高，提示炎症越严重［26⁃27］。研究结果表明，模型组左侧子宫摄取值高于假手术组（P＜0.01）；桂枝茯苓胶囊给药28 d后，大鼠左侧子宫放射性摄取值均降低（P＜0.01）。结果提示，桂枝茯苓胶囊对盆腔炎模型大鼠子宫炎症具有一定的保护作用。

综上所述，本研究成功地复制了大鼠盆腔炎模型，并使用放射自显影、γ 计数和MicroPET 方法评价了桂枝茯苓胶囊的抗炎作用，结合桂枝茯苓胶囊对盆腔炎模型大鼠子宫组织病理及炎性因子IL⁃1β、TNF⁃α 的影响，18F⁃FDG MicroPET 技术能有效评价桂枝茯苓胶囊对盆腔炎模型大鼠子宫损伤的改善作用。