廖思晨， 田 露， 王旭阳， 龚国利

(陕西科技大学 食品科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

随着生物技术的发展，人们开始重视生物安全及防控治理等问题.目前，化学品的广泛使用不仅会破坏微生物的生态平衡，还会导致耐药菌株的出现、污染地下水和人类健康风险.因此，迫切需要开发新的环境友好型产品来替代化学药品，以防控各种有害生物[1].

微生物脂肽是一种新型生物活性分子，主要由芽孢杆菌生产的分子量为700-2 000 Da的天然小分子肽.它们大多能与细胞膜互相作用，表现出抗菌和细胞抑制活性，具有抗微生物、抗肿瘤、表面活性强、易降解、不易诱发耐药性、对低pH环境和高温耐受性好等功能和特性.因此，脂肽化合物在植物生物防治、化妆品、制药、食品、饲料和洗涤剂等领域受到高度关注[2].在农业上可用于生物防治，具有定殖、促生长及拮抗作用，可诱导植物系统获取抗性，启动免疫反应.此外，它还可以用作抗生素、饲料添加剂、乳化剂和发泡剂等[3-5].Kumar等[6]研究了解淀粉芽孢杆菌RHNK22产生的化合物Iturin A，该化合物对农业害虫之一斜纹夜蛾(Spodopteralitura)具有很强的抑制作用.Wafa等[7]报道了由假单胞菌属细菌(Pseudomonassp.)和伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp)产生的微生物脂肽，可以作为杀虫剂、除草剂、杀虫剂和杀菌剂的佐剂，能够安全的应用到生物农药中.

由于脂肽天然安全和优异的抗菌性能，市场对其需求不断激增，新型脂肽化合物的发现数量也呈指数增长，在生物安全范畴具有一定的研究价值和应用前景.本研究旨在从特殊环境碱蓬中分离具有防治致病菌潜力的脂肽wxy-b3菌株，为其进一步开发和应用提供了理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

1.1.1 植物样品

植物碱蓬组织取自于陕西省榆林市盐碱地.

1.1.2 指示菌

大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、马铃薯干腐病菌(Fusariumsambucinum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和苹果腐烂病菌(Cytosporamandshurica).冻存菌种保藏于-80 ℃冰箱中.

1.1.3 主要试剂

磷酸氢二钠、半胱氨酸、乙酸、甘露醇、氯仿(天津市东丽区天大化学试剂厂)，氯化钾、茚三酮(天津市天力化学试剂有限公司)，胰蛋白胨、牛肉浸膏(北京奥博星生物技术有限公司).

1.1.4 主要仪器

THZ-98A恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司)，BIS-910凝胶成像仪(北京东胜创新生物有限公司)，DYY-11电泳仪(北京市六一仪器厂)，UV-5200紫外分光光度计(上海分析仪器有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 碱蓬内生菌的分离

将新鲜碱蓬的根、茎、叶以75%酒精冲洗，放入5% NaClO溶液中表面消毒5 min，随后在Na2S2O3溶液中浸泡中和3 min，使用无菌水冲洗2-3次，并以最后一次作为冲洗对照.称取1 g左右消毒后的碱蓬组织，加入5 mL无菌水在研钵内研磨均匀.再吸取100 μL的上清液均匀涂布于不同盐(NaCl)浓度(0%、3%、5%、10%)的LB固体培养基中，37 ℃培养18 h.挑取不同颜色、形态的菌落于相应盐浓度的细菌培养基平板上进行划线培养，培养至获得单菌落扩大培养后转接于甘油冻存管中，-80 ℃冻存.

1.2.2 碱蓬内生菌的抑菌活性

(1)内生菌菌株的发酵上清液制备：挑取内生菌菌株的单菌落于LB液体培养基中37 ℃培养24 h，6 000 rpm离心10 min后取上清液作为样品使用.

(2)牛津杯法[8]测定内生菌对细菌的抑菌活性：接种5%的细菌指示菌，37 ℃振荡培养至细胞浓度为108CFU/mL (OD600 nm=0.5).待培养皿中水琼脂稍凝固后放入无菌牛津杯，使指示菌液与冷却至约45 ℃的LB固体培养基以3%的比例混合，倒在水琼脂上.凝固后，吸取100 mL样品，37 ℃培养18 h后察看有无抑菌圈.

(3)滤纸片法[9]测定内生菌对真菌的抑菌活性：用无菌棉签蘸取孢子及菌丝，轻轻按压至改良的马丁固体平板上，30 ℃培养2～3 d，直至平板中心长出直径约1.5～2 cm的菌落.将直径约1 cm的无菌滤纸片浸入发酵上清液中，稍干后将滤纸片放入菌落周围.30 ℃培养2～3 d观察是否形成抑菌圈.

1.2.3 脂肽合成基因的扩增

根据芽孢杆菌脂肽家族的生物合成基因簇，在生物工程(上海)有限公司合成Surfacins，Fengycins，Iturins引物，序列见表1所示.参照侯华[10]的改进方案进行PCR扩增：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；58 ℃复性60 s；72 ℃延伸90 s；循环30次；72 ℃延伸10 min.

表1 部分脂肽基因的引物

1.2.4 薄层色谱层析(TLC)

内生菌菌株的发酵上清液制备方法同1.2.2.配制10 mL配比为氯仿∶甲醇∶冰醋酸∶水=65∶30∶4∶4的溶液，静置分层取下层清液作为展开剂[11].而后在距离TLC板底部约1 cm处画一条直线，在直线上等间隔点四个点用毛细玻璃管吸取样品点样，干燥后点样2～3次.待样品干燥后，将TLC板倾斜放入展层缸中，吸入约5 mL展开剂没过底部.用玻璃板盖住顶盖，防止溶剂挥发.

1.2.5 菌种鉴定

(1)菌落形态学观察

将分离得到的单菌株wxy-b3在含3% NaCl的LB固体培养基上划线，37 ℃培养18 h，察看wxy-b3菌落的形态、颜色、大小和透明度等外观特征.

(2)扫描电镜

参照Cai等[12]描述的方法并进行改良.按照1.2.2中所述的方法获得菌悬液(OD600nm=0.5)，离心后向菌体沉淀中加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃静置固定12 h，使用PBS洗濯菌体2-3次，再用30%、50%、70%、80%、90%和100%浓度的乙醇溶液脱水菌体，每次10 min.随后重悬于乙酸异戊酯中30 min，6 000 rpm离心10 min后在烘箱中烘干2 h.最后，用牙签移取适量样品粘在载物台上，渡金后进行电镜观察(MLA 650,FEI,Hillsboro,USA).

(3)生理生化指标

依据《伯杰氏细菌鉴定手册》[13]和《常见细菌系统鉴定手册》[14]中的方法进行测定.

(4)16S rDNA鉴定

根据邢旋等[15]的改进方法实施16S rDNA的扩增.将从细菌基因组提取试剂盒中提取各菌株的DNA为模板，用细菌16S rDNA序列的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)以及1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)用于扩增.PCR反应体系为：2 μL100 ng/μL DNA模板、1 μL10.74 nmol上游引物、1 μL10.69 nmol下游引物、10 μL Mix酶和6 μL ddH2O.其中DNA模板为提取的菌株基因组DNA.

所获取的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生物(上海)公司测序.利用NCBI比对得到菌株16S rDNA序列，以及相似序列的其他菌株序列.MEGA 7.0软件构建系统进化树.

2 结果与讨论

2.1 碱蓬内生菌菌种库的构建

将耐盐植物碱蓬的根、茎和叶置于含0%、3%、5%、10% NaCl的LB固体培养基中，分别分离得到了21株内生细菌和24株内生真菌.其中，从0% NaCl的LB固体培养基中筛选出9株内生细菌，命名为wxy-b(1～5、18～21)，如图1(a)～(e)、(r)～(u)所示.从3% NaCl的LB固体培养基中筛选得到6株内生细菌，命名为wxy-b(6～11)，如图1(f)～(k)所示.从5% NaCl的LB固体培养基中筛选出4株内生细菌，命名为wxy-b(12～13、16～17)，如图1(l)～(m)、(p)～(q)所示.从10% NaCl的LB固体培养基中筛选得到2株内生细菌，命名为wxy-b(14～15)，如图1(n)～(o)所示.

图1 碱蓬内生细菌

另外，从0% NaCl改良的马丁培养基中筛选得到一株内生真菌，命名为wxy-f22，如图2(v)所示.从3% NaCl的改良马丁培养基中筛选出10株内生真菌，命名为wxy-f(1～9、23)，如图2(a)～(i)、(w)所示.从5% NaCl的改良马丁培养基中筛选出7株内生真菌，命名为wxy-f(10～17)，如图2(j)～(q)所示.从10% NaCl的改良马丁培养基中筛选得到6株内生细菌，命名为wxy-f(18～21、24)，如图2(r)～(u)、(x)所示.

图2 碱蓬内生真菌

2.2 碱蓬内生菌抑菌活性

为了检测内生菌株的次生代谢产物是否具有抑菌活性，本文利用部分指示菌对21株内生细菌和24株内生真菌的代谢产物进行抑菌检测.结果发现4株内生细菌和7株内生真菌的代谢产物均具备抑菌作用，但大多菌株只有窄谱的抑菌活性.如表2所示，细菌wxy-b10和12只抗苹果腐烂病菌，真菌wxy-f2、3和9只抗番茄灰霉病菌，真菌wxy-f18和19仅有马铃薯干腐病菌抑制活性.细菌wxy-b4对小麦赤霉病菌和苹果腐烂病菌有抑制活性，真菌wxy-f16和22对番茄灰霉病菌和马铃薯干腐病菌有抑制作用.这些菌株大多具备抑制植物病原真菌生长的活性.其中，细菌wxy-b3表现出较广谱的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、小麦赤霉病菌、马铃薯干腐病菌和苹果腐烂病菌等均具有抑制作用.

表2 碱蓬内生菌抑菌谱

2.3 脂肽合成基因的PCR扩增结果

对上述具有抑菌活性的菌株进行脂肽合成基因的PCR扩增结果显示，只有菌株wxy-b3含有脂肽生物合成相关基因，见图3所示.该菌株含有Iturin家族的ituD和bamC生物合成基因，扩增片段大小为750～1 000 kb，而Fengycin家族的fenA、fenB、fenD基因和Surfacin家族的srfA基因未扩增出.依据脂肽生物合成基因扩增结果，推断出菌株wxy-b3可能产生Iturin家族的脂肽Iturin A和Bacillomycin D.

图3 菌株wxy-b3脂肽生物合成基因的PCR产物电泳图

2.4 TLC分析

菌株wxy-b3发酵上清液的TLC分析见图4所示.结果显示，品层析后硅胶板上出现4个淡黄色斑点.根据氨基酸或肽与茚三酮在加热条件下产生紫红色或黄色的原理[16]，可以得知菌株wxy-b3的发酵上清液中至少含4种蛋白质或肽类产物，证明菌株wxy-b3有产生蛋白质或肽的能力.由于菌株wxy-b3具有Iturin A和Bacillomycin D的合成基因，因此可能含脂肽化合物.此外，茚三酮与脯氨酸和羟脯氨酸反应生成了黄色物质，这表明菌株wxy-b3产生的蛋白质或肽的氨基酸组成中含有脯氨酸.

图4 wxy-b3菌株发酵上清液的薄层色谱层析结果

2.5 菌种鉴定结果

菌落的形态特征和细胞形态见图5所示.根据菌落形态和扫描电镜可以看出菌株wxy-b3为杆状菌体，大小为0.6～0.7 μm×3～4 μm.LB培养基上出现白色菌落，有裂纹，边缘粗糙，表面干燥不透明.

生理生化特征见表3所示.结果显示，过氧化氢酶试验、淀粉酶试验、MR试验、明胶水解均为阴性，氧化酶试验、脲酶试验、酯酶试验、酪素降解试验、吲哚产生试验、硫化氢产生试验、硝酸盐还原试验、V-P试验结果均为阳性.说明菌株wxy-b3能分解利用甘露糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等糖醇类物质生长.这表明菌株wxy-b3具备《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》中常见芽孢杆菌属的特征.

图5 wxy-b3菌株的菌落及扫描电镜

表3 菌株wxy-b3的生理生化特征

通过PCR扩增菌株wxy-b3的16S rDNA，获得大小为1 000～1 500 kb的条带，见图6所示.公司测序后获得长度为1 488 bp的16S rDNA序列，其NCBI数据库登录号为：SUB 10918382 Bacillus OM189446，见图7所示.经BLAST比对后构建系统发育树，发现菌株wxy-b3与芽孢杆菌属成簇，与B.amyloliquefaciens(IMA10)的同源性最高，达到100%，如图8所示.其构建系统发育树所用序列信息如表4所示.

图6 菌株wxy-b3 16S rDNA的PCR产物电泳图

图7 菌株wxy-b3的16S rDNA 碱基序列

图8 菌株wxy-b3的系统进化发育树

表4 构建系统发育树所用序列信息

因此，菌株wxy-b3为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens.

3 结论

本研究从植物碱蓬组织中分离得到具有产脂肽能力的植物内生菌株，对其发酵产物进行了抑菌活性测定，发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、马铃薯干腐病菌和苹果腐烂病菌等均具有抑制活性，并对其进行脂肽合成基因的PCR扩增，其中菌株wxy-b3含有Iturin家族脂肽的合成基因.继而对菌株wxy-b3进行了TLC分析，发现能产生4种含有脯氨酸的蛋白质或肽类组分.因此，菌株wxy-b3可确定具有产生抗菌脂肽的能力，推测其可以产生Iturin家族脂肽.并经过形态学察看、生理生化实验、16S rDNA鉴定，将菌株wxy-b3归类为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens).本文为菌株wxy-b3的进一步开发和应用提供了理论基础.