刘千正 林颢 黄静 蔡义侠

骨肉瘤是一种青少年常见的原发性骨肿瘤[1]。据统计，在我国，骨肉瘤发病率约为 3 / 100 万，而在 15～ 19 岁青春期患者中发病率可达 11 / 100 万[2]，且有逐年上升趋势，是青少年癌症死亡的主要原因。由于缺乏特异性诊断标志物及检测指标，约 85% 的患者首诊时即出现难以察觉的微小转移[3-4]。近几十年来，以外科手术为基础联合化疗的综合治疗策略已成为骨肉瘤的标准治疗模式，患者的 5年生存率从 70% 提升至 82%[5]。然而手术切除常常影响患者的运动功能，具有较高的致残率；而主流的化疗药物副作用大、易耐药且缺乏特异性，导致治疗效果差，容易复发及转移。而恶性程度高、早期易转移、治疗后易复发是影响骨肉瘤患者生存率的重要因素。研究表明，骨肉瘤的发生与年龄、性别和身高等危险因素以及家族遗传等密切相关，但其确切病因尚不明确，骨肉瘤的发病机制有待进一步阐明[6]。因此，研究骨肉瘤发病的相关分子机制，寻找特异性的生物标记，有助于协助筛选临床的早期患者，及时预警，寻找靶向位点。环状 RNA (circular RNA，circRNA)是一种新兴的、广泛存在、丰富且进化保守的非编码 RNA，是近年来生命科学研究的热点。首个 circRNA 最早于 1976年在植物感染的类病毒及副流感病毒颗粒中被发现[7]，不久后在人类及动物体内也被检测到[8]。根据起源的差异，将 circRNA 分为 3 类，包括外显子 circRNAs (ecRNAs)[9-10]，外显子 - 内含子 circRNA (elciRNAs)[11]和圆形的内含子 RNA (ciRNAs)[12]。有研究表明，circRNA 具有包括充当 miRNA“海绵”、蛋白质“海绵”、与 RNA 结合蛋白相互作用、选择性剪接及转录调控、翻译蛋白及编码肿瘤相关功能短肽等多种生物学功能 (图1)。circRNA 可能与多种疾病的发生发展相关，有望作为疾病的新型生物标记。近年来，越来越多的证据表明 circRNA 在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[13]。circRNA 与喉癌、结肠癌、肺癌、肝癌、肾癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、乳腺癌、脑胶质瘤、白血病、淋巴瘤[14-26]等多种恶性肿瘤和疾病有密切的关系。已有研究报道了 circRNA 与骨肉瘤间的关系，现将就 circRNA 与骨肉瘤的研究现状综述如下。

图1 a：circRNA 与 miRNA 竞争性结合，抑制了 miRNA 对于 mRNA 的作用；b：circRNA 直接与蛋白质结合，发挥其海绵作用，也可以直接与 RBP 结合发挥作用；c：circRNA 通过与 POL Ⅱ 结合调控转录同时也与 mRNA 前体剪接竞争；d：circRNA 翻译蛋白和肿瘤相关功能短肽Fig.1 a: Circular RNA competitively binds to miRNA and inhibits the effect of miRNA on mRNA; b: Circular RNA directly binds to protein to play its sponge role, and can also directly bind to RBP to play its role; c: Circular RNA regulates transcription by binding to Pol Ⅱ and competes with mRNA precursor splicing; d: Circular RNA translation proteins and tumor-related functional short peptides

一、circRNA 在骨肉瘤中存在异常表达

circRNA 在许多肿瘤组织中异常表达，有可能成为肿瘤诊断和治疗的潜在生物标记 (表 1)。Liu 等[27]利用 Arraystar 芯片技术检测人成骨细胞与骨肉瘤细胞获得微阵列的骨肉瘤 circRNA 表达谱 (GSE96964)，其中一共有 110 个明显差异表达的 circRNA，包括 8 个明显上调和 102 个明显下调的 circRNA；作者利用芯片技术检测人成骨细胞与骨肉瘤细胞，发现存在 252 种差异性表达的 circRNA，在骨肉瘤细胞中有 71 种表达上调，181 种表达下调。这些差异表达的 circRNA 导致骨肉瘤的生物学及遗传信息发生改变并最终引起了恶性生物学行为，预示着 circRNA 在骨肉瘤的发展和进程中起着重要作用。

表1 circRNA 在骨肉瘤中的表达Tab.1 Expression of circular RNA in osteosarcoa

二、circRNA 影响骨肉瘤的诊断、治疗及预后

传统的骨肉瘤中的肿瘤标志物主要有糖蛋白 (glycoproteins)、多肽 (polypeptides)、糖脂 (glycolipids)、多胺 (polyamine)和免疫球蛋白、肿瘤胚胎抗原 (on-cofetal antigens)、激素 (hormones)和酶类 (en-zymes)等，但特异性不强。目前，临床诊断主要依赖临床表现，影像学检查以及病理活检去确诊[31]。如今 circRNA 作为研究新热点，其作为骨肉瘤肿瘤标志物的作用逐渐被发现，Zhu 等[32]通过对比化学耐药和化学敏感骨肉瘤细胞系发现 hsa_circ_0081001 在化学耐药骨肉瘤细胞、组织和血清中上调，可以动态监测和反映骨肉瘤患者的病情变化，相比碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶有更好的诊断效能，可以在小规模的前瞻性临床预测试中动态监测和反映骨肉瘤患者的病情变化。传统的骨肉瘤治疗方法包括手术切除，放疗和化疗，化疗作为治疗骨肉瘤的标准辅助治疗方法，化学抗药性是影响骨肉瘤预后的主要因素。Wu 等[33]发现抑制骨肉瘤细胞系中 circ_001569 的活性可导致阿霉素，甲氨蝶呤或顺铂的 IC50 值降低，而 Wnt / β-catenin 途径激动剂补偿了降低的 IC50 值，说明 circ_001569 可通过 Wnt / β-catenin 途径促进顺铂耐药。Hu 等[34]发现 Circ-LARP4 在肿瘤组织中低表达并且与 Enneking 阶段呈负相关，高表达患者辅助化疗的肿瘤细胞坏死率增加同时可提高 MG63 细胞对顺铂和阿霉素的化学敏感性。Kun-Peng 等[29]发现在具有化学抗性的骨肉瘤细胞中有 80 个 circRNA 失调，其中 hsa_circ_0004674 在骨肉瘤化疗耐药细胞和组织中明显增加，与不良预后有关，说明 hsa_circ_0004674 可能是骨肉瘤细胞化学耐药的候选靶点。Kun-Peng 等[35]发现 circPVT1 在骨肉瘤组织，血清和化学耐药细胞系中显着上调，敲除 circPVT1 可以通过降低经典的耐药相关基因 ABCB1 的表达而减弱骨肉瘤细胞对阿霉素和顺铂的耐药性。除了治疗手段对骨肉瘤预后的影响，影响骨肉瘤预后的因素还有很多，例如：肿瘤大小，Enneking 分期和远处转移的发生。Nie 等[36]通过骨肉瘤组织与癌旁组织对比发现 circ-NT5C2 在骨肉瘤组织中显著上调，进行 Kaplan-Meier 生存分析以分析 circ-NT5C2 表达与患者的总生存 (overall survival，OS)和无病生存 (disease free survival，DFS)的关系，发现高表达患者的 OS (P= 0.006)和 DFS (P= 0.001)短，说明 Circ-NT5C2 可能与骨肉瘤预后不良存在密切关系。随着对 circRNA 的研究，其对骨肉瘤的诊断、治疗及预后的影响机制被逐渐发现，为提高骨肉瘤患者生存率及改善预后提供了新思路。

三、circRNA 影响骨肉瘤的恶性生物学行为

骨肉瘤的增殖与凋亡是一个涉及多因素，基因和步骤的复杂过程。目前，对这过程的机制仍在探索中。Cao 等[37]发现 circ-0060428 在骨肉瘤中异常高表达，可以促进骨肉瘤细胞增殖并降低其细胞凋亡，circ-0060428 通过刺激 miR-375 来上调骨肉瘤细胞中 RPBJ 的表达来调节凋亡相关蛋白 (Bax，Bcl-2 和 Caspase-3)的表达。除此之外，一些学者通过异体移植骨肉瘤细胞至裸鼠体内，发现某些 circRNA 的过度表达，如 circ 0001721 和 circ 0000502，促进了肿瘤体积和重量的增加[38-39]。

骨肉瘤具有很强的迁移和侵袭能力，大多数患者早期发现有肺部转移，越来越多的研究发现 circRNA 对骨肉瘤的迁移和侵袭的影响。Yang 等[40]在晚期骨肉瘤，转移性肿瘤和复发性肿瘤中均发现 circ_0001105 低表达，circ_0001105 的过表达降低了转移相关蛋白 MMP-2，MMP-7 和 MMP-9 的水平从而抑制了 U2OS 和 MG63 细胞的迁移和侵袭，这表明过表达 circ_0001105 可抑制骨肉瘤的迁移和侵袭作用。Liu 等[41]发现 circPVT1 在骨肉瘤细胞中高表达，敲低 circPVT1 可抑制细胞迁移和侵袭同时降低 MG63 和 U2OS 细胞中 N-钙黏着蛋白，波形蛋白和 Snail 的蛋白质表达水平，这说明 circPVT1 通过增强细胞上皮 - 间质转化 (EMT)促进骨肉瘤侵袭和转移。

上述研究表明 circRNA 与骨肉瘤的恶性生物学行为有着密切的联系，通过对其机制的研究为找到骨肉瘤潜在的治疗靶点提供了依据，为骨肉瘤的精准治疗开辟了道路。

综上所述，circRNA 在骨肉瘤组织和细胞中存在异常表达并引起恶性生物学行为，对骨肉瘤的发生与进展起到重要作用。然而，如今对于 circRNA 还是知之甚少，许多 circRNA 仍未被发现，其在骨肉瘤中的功能和作用机制尚未得到证实，circRNA 间的相互作用对于骨肉瘤的影响尚不明确，临床应用的骨肉瘤肿瘤标志物甚少。所以，进一步研究 circRNA 对骨肉瘤发生、进展及预后的影响，为骨肉瘤的靶向精准治疗提供了可能，有助于提高骨肉瘤患者的综合治疗能力及生存率；探究 circRNA 作为骨肉瘤生物标志物的功能，发现更多灵敏度高，特异性强的 circRNA 作为骨肉瘤肿瘤标志物将更好地提高临床诊断及病情监测能力，做到早期发现，早期治疗，改善患者预后水平。circRNA 作为非编码 RNA 中的一个新热点，其对骨肉瘤的发生发展有着密切的联系，更好地了解 circRNA 之间的关系有助于找到诊治骨肉瘤的新突破口。