田雅宁，陈远哲，王巧华,2,3,*

（1.华中农业大学工学院，湖北 武汉 430070；2.国家蛋品加工技术研发分中心，湖北 武汉 430070；3.农业农村部长江中下游农业装备重点实验室，湖北 武汉 430070）

皮蛋又名松花蛋、变蛋，是我国特有的传统风味禽蛋制品[1]，含有丰富的营养成分，具有清热去火，止咳润肺等功效[2-4]，深受消费者喜爱[5]。传统的清料皮蛋是利用碱液、铜盐及红茶等原料复配成腌制液浸泡鸭蛋进行腌制[6-7]，从而使鸭蛋形成独特的松花、颜色及弹性凝胶[8]。皮蛋凝胶是判断其腌制品质的重要指标[9]。

蛋壳作为皮蛋腌制液与蛋内部环境物质交换的第一道屏障，是皮蛋腌制的重要介质。蛋壳内部的蛋壳膜分为内膜及外膜，两种蛋壳膜内部均呈现为一种由角蛋白和少量黏蛋白纤维交织构成的网状结构，有利于皮蛋凝胶贴壁生长。同时，蛋壳膜作为一种半透性亲水生物活性膜，具有良好的透气性，交织的纤维茎秆形成的孔隙可作为有效的皮蛋腌制液渗透通道[10-13]。Wang Yuting等[14]发现皮蛋内部的水分会透过蛋壳流失到壳外，并出现蛋白质类物质降解、游离氨基酸含量缓慢增加的现象，同时，产生挥发性碱性含氮物质，导致pH值降低。

蛋品的新鲜度是衡量蛋内部品质的核心指标，不同新鲜度鸭蛋内部所含的营养物质及理化指标具有一定差异[15]。随着贮藏时间的延长，原料蛋的新鲜度降低，鸭蛋蛋清中蛋白质含量及结构功能也产生变化，且蛋白质变性过程是皮蛋凝胶形成的关键反应。研究表明当蛋清沉浸在强碱环境中时，卵清蛋白（蛋清中的主要蛋白质）的二级和三级结构被破坏，从而导致解折叠[13]。随后，这些蛋白质链逐渐形成聚集体，最终形成稳定的蛋清凝胶网络[16-17]。因此，原料蛋新鲜度的变化会对皮蛋的凝胶形成过程产生影响。

以往对皮蛋的研究多是针对皮蛋的无损检测方法或是加工过程中皮蛋凝胶变化情况[18-20]，但有关原料蛋新鲜度对蛋壳、膜的超微结构的影响，以及蛋壳及蛋壳膜与腌制期间皮蛋品质变化的关联等问题鲜见报道。因此，本研究以不同新鲜度的鸭蛋作为原料蛋进行腌制，通过扫描电子显微镜获取腌制过程中蛋壳内膜、外膜及蛋壳断面的图像，经过处理分析获取各项图像系数，结合皮蛋在腌制期间凝胶品质指标的变化规律来探寻原料蛋新鲜度与腌制期间皮蛋的凝胶品质、蛋壳及壳膜的变化趋势及相关关系，以期为后续皮蛋腌制过程的品质控制与检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜青壳鸭蛋 河南特产馆。乙醇（95%（体积分数，下同））（分析纯）、氢氧化钠（质量分数95%）（分析纯）、硫酸铜（食品级） 国药集团化学试剂有限公司；红茶 福建省合盛康生物科技有限公司；食盐中盐上海市盐业有限公司。

1.2 仪器与设备

TMS-PRO质构仪 美国Food Technology Corporation公司；JFC-1600离子溅射装置、JSM-6390 LV扫描电子显微镜 日本Nissan Technical Center公司；JY3002电子天平 上海精密科学仪器有限公司；EA-01蛋品质分析仪 以色列奥卡食品科技有限公司；电子游标卡尺 上海美耐特实业有限公司；JYD-400拍击式均质器 上海之信仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 皮蛋的腌制

根据体系质量以氢氧化钠4.5%、硫酸铜0.4%、食盐4%、红茶3%和水88.1%的比例腌制皮蛋[21]。

将同一批次的540 枚新鲜鸭蛋分为3 组，每组各180 枚，分别在室温下贮藏0、16、32 d，原料蛋根据贮藏时间不同，以新鲜度差异分为A、B、C 3 组，分别放入3 个腌制箱中进行腌制。另选取50 枚大小、形态相近的鸭蛋为对照组，不腌制，测定其新鲜度及超微结构。实验为期40 d，其中0～33 d为腌制期，34～40 d为贮藏期，在开始腌制的第33天将皮蛋从腌制液中取出，擦除表面残留腌制液后在室温下贮藏，因皮蛋凝胶自腌制第8天开始形成[22]，故以第0、8、13、16、19、22、25、40天为取样日期[20]，每次取20 枚测定各指标。其中，第0天测定各批次原料蛋的新鲜度及蛋壳、膜超微结构，自第8天起增加测定凝胶pH值、含水率及质构参数。根据皮蛋的成品数量与皮蛋总数的比值计算皮蛋成品率。

1.3.2 皮蛋内容物理化指标测定

含水率的测定参考陈远哲等[23]的方法。用电子天平称取皮蛋蛋白凝胶与蛋黄各10 g切碎，选用洁净、干燥的金属铝盒称质量记为m3/g，将样本放入铝盒后称质量记为m1/g，置于105 ℃电热鼓风烘干箱内烘干后样本与铝盒称质量记为m2/g，皮蛋样本的含水率按公式（1）计算。

pH值的测定参考GB/T 5009.47—2003《食品安全国家标准 蛋与蛋制品卫生标准的分析方法》。将皮蛋凝胶与蛋黄分离，按m（皮蛋凝胶）∶V（水）＝2∶1的比例加蒸馏水稀释，捣成匀浆，称取15.00 g匀浆，加水搅匀，稀释至150 mL，用双层纱布过滤，量取50 mL匀浆测其pH值。

1.3.3 皮蛋质构参数测定

将皮蛋样本的凝胶部分剥落，切割成1 cm×1 cm×1 cm的正方体，利用质构仪进行质地剖面分析，测定条件：测试前速率1 mm/s、测试速率1 mm/s、测试后速率1 mm/s、压缩程度60%、间隔5 s，平行测定20 次。

1.3.4 原料蛋新鲜度的测定方法

应用蛋品质分析仪测定原料蛋的哈夫单位，计算方法如公式（2）所示。

式中：h为蛋清高度/mm；m为鸭蛋质量/g。

利用电子游标卡尺测量蛋黄高度及蛋黄直径，平行测量3 次，取平均值，蛋黄指数计算如公式（3）所示。

式中：H为蛋黄高度/mm；φ为蛋黄直径/mm。

1.3.5 蛋壳膜品质测定

将蛋壳内膜、外膜从钝端气室处剥离，用乙醇溶液浸泡清洗并晾至干燥状态[24]。将制备好的样品裁剪至4 mm×4 mm大小，分别将蛋壳膜样本的内膜内表面、内膜外表面、外膜内表面、外膜外表面顺序粘贴至样品台。在扫描电子显微镜下观察，蛋壳膜表面的放大倍数为2 000，并将不同放大倍数下获取的超微结构图像保存。

1.3.6 孔隙度的计算

选取蛋壳内膜与外膜放大2 000 倍的扫描电子显微镜图像，利用Image J软件计算出蛋壳膜纤维茎杆的孔隙度，如公式（4）所示。

式中：s为空隙面积；S为图像总面积。

1.3.7 皮蛋内部菌落总数测定方法

根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法对样品皮蛋中菌落总数的含量进行测定。将皮蛋表面清洗干净，称取25 g皮蛋样品置于装有225 mL生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打2 min，制成质量分数10%的皮蛋匀液。吸取1 mL匀液于无菌培养皿内，每个浓度做两次重复，倒入适量琼脂并转动平皿使其混合均匀，待琼脂凝固后，将平板翻转，置于36 ℃培养箱中培养48 h后计数。

1.4 数据处理与分析

实验数据用平均值±标准偏差表示，使用Duncan多重比较法进行显著性分析，使用Pearson相关性分析法对数据进行相关性分析。应用Image J软件对蛋壳及壳膜的超微结构图像进行图像处理及分析，获取3 批次样品的超微结构数据。

2 结果与分析

2.1 原料蛋新鲜度对腌制期间皮蛋内容物理化指标的影响

2.1.1 原料蛋新鲜度对腌制期间皮蛋含水率的影响

如图1所示，3 组皮蛋在腌制前16 d含水率呈剧烈下降的趋势，且同时期含水率均为A组＜B组＜C组，C组与A、B两组之间存在显著差异（P＜0.05），原因可能是蛋壳膜孔隙度随原料蛋新鲜度的降低而升高，因此腌制液更易渗透入皮蛋内使C组皮蛋含水率较高。在腌制第16天时，3 组皮蛋的含水率之间无显著差异（P＞0.05），自第16天后，3 组皮蛋的含水率均呈现降低趋势，原料蛋新鲜度与含水率呈正相关关系。第40天时，A组与B、C组之间具有显著性差异（P＜0.05），B组与C组无显著性差异（P＞0.05）。

图1 不同新鲜度原料蛋在皮蛋腌制期间含水率的变化Fig. 1 Changes in moisture content of raw eggs with different freshness during preserved egg pickling

2.1.2 原料蛋新鲜度对腌制期间皮蛋pH值的影响

如图2所示，原料蛋的pH值随新鲜度的降低而略有上升，其主要原因是二氧化碳从蛋壳上的气孔溢出，而溢出的二氧化碳呈酸性，随着贮存时间的延长，二氧化碳含量逐渐减少，使得pH值呈上升趋势。在腌制过程中A组与C组之间除第8、13天外均具有显著性差异（P＜0.05），随着腌制时间的延长，3 组皮蛋凝胶的pH值均呈现总体下降的趋势，第16天时呈现首个最低点，且A组与B、C组存在显著性差异（P＜0.05）。第19天时凝胶的pH值升高，且原料蛋新鲜度越高，凝胶pH值的回升幅度越大。第40天，A组与B、C两组之间具有显著性差异（P＜0.05），B组与C组之间无显著性差异（P＞0.05）。

图2 不同新鲜度原料蛋在皮蛋腌制期间凝胶pH值的变化Fig. 2 Changes in gel pH of raw eggs with different freshness during preserved egg pickling

2.2 原料蛋新鲜度对腌制期间皮蛋凝胶质构特性的影响

皮蛋的质构特性主要与凝胶形成程度以及蛋白质结构有关，腌制过程中腌制液渗透入蛋内与内容物相互作用使蛋白质变性，从而引起凝胶质构特性的变化。原料蛋新鲜度与腌制期间皮蛋凝胶品质密切相关，由图3可知，皮蛋在腌制过程中凝胶硬度、弹性均呈现出波动上升的趋势。腌制前19 d，3 种新鲜度皮蛋的凝胶硬度无显著性差异（P＞0.05），自第22天起，A组与C组的硬度之间具有显著性差异（P＜0.05），B组与另两组之间差异不显著（P＞0.05）。腌制进行到第40天，3 组皮蛋凝胶的硬度均达到峰值，此时皮蛋凝胶硬度随原料蛋新鲜度的降低而升高，C组凝胶硬度为3 组中最大（9.43 N），A组的凝胶硬度最小（6.00 N）。同时，由图3B可知，腌制过程中除16～22 d外，A、C两组原料蛋凝胶弹性之间均具有显著性差异（P＜0.05）。

图3 不同新鲜度原料蛋在皮蛋腌制过程中凝胶的质构特性变化Fig. 3 Trend of gel texture characteristics of raw eggs with different freshness during the pickling process of preserved eggs

2.3 原料蛋新鲜度分析结果

由表1可知，A组新鲜原料蛋与B组次新鲜原料蛋之间哈夫单位差异不显著（P＞0.05），与C组不新鲜原料蛋之间哈夫单位存在显著差异（P＜0.05），B组与C组原料蛋的哈夫单位差异不显著（P＞0.05）。同时，A组的蛋黄指数与另两组之间具有显著性差异（P＜0.05），B组与C组的蛋黄指数之间无显著性差异（P＞0.05）。

表1 原料蛋新鲜度的哈夫单位和蛋黄指数Table 1 Haugh unit and egg yolk index for raw egg freshness

2.4 蛋壳内外膜品质变化

不同新鲜度原料蛋在腌制第0天时，蛋壳膜内膜纤维茎秆交织的致密程度随新鲜度降低逐渐下降，孔隙度上升，其中A组的纤维交叠最紧密（图4A），C组第0天时每一层茎杆纤维的数量略有减少，可观察到茎杆间有孔洞出现（图4C2）。

图4 不同新鲜度原料蛋在腌制第0、40天蛋壳膜内膜微观结构比较（2 000×）Fig. 4 Comparison of inner eggshell membrane of raw eggs with different freshness on the 0th and 40th days of curing (2 000 ×)

对同批次腌制前后的皮蛋进行对比发现，由于腌制液中碱液及金属离子的不断渗透腐蚀作用，重叠的纤维茎杆层数逐渐减少，交织的致密程度下降，可观察到明显的孔隙（图4），腌制第40天时蛋壳膜内膜孔隙度显著增大。

由图5可见，蛋壳外膜相比于内膜的纤维茎秆直径略显增大。不同于蛋壳内膜与皮蛋内容物直接相连[25]，内膜的纤维茎秆上存在被腐蚀的蛋白颗粒，蛋壳外膜的茎秆分布更为清晰，且原料蛋新鲜度越低，其外膜的纤维直径越大，纤维之间的孔径也随之升高。同时，蛋壳外膜茎秆较粗，交织的致密性更低。随着腌制过程的进行，腌制40 d时蛋壳膜外膜在腌制液的腐蚀作用下孔隙度有所上升，其中C组外膜内侧孔隙度最大。

图5 不同新鲜度原料蛋在腌制第0、40天蛋壳膜外膜微观结构比较（2 000×）Fig. 5 Comparison of outer eggshell membrane of raw eggs with different freshness on the 0th and 40th days of curing (2 000 ×)

2.5 原料蛋新鲜度对腌制期间皮蛋蛋壳膜孔隙度的影响

蛋壳膜是由蛋白纤维茎秆交织而成的多孔网状结构[26]，随着茎秆的粗细、交织的致密程度与纤维层数的变化而具有不同形态。蛋壳膜作为皮蛋内容物与皮蛋腌制液之间进行物质交换的通道，随着腌制期间碱液不断渗透腐蚀会造成其结构发生改变。孔隙度能够反映这种结构变化，故选取蛋壳膜的内膜外侧与外膜内侧作为实验样本进行孔隙度分析。以新鲜蛋腌制第0天内膜外侧为例，经扫描电子显微镜拍摄后图片效果模糊（图6A），故利用Image J图像处理软件对纤维茎秆之间的孔隙进行识别分析（图6B），红色区域即为孔隙识别部分，表征蛋壳膜内外进行物质交换通道的密度。

图6 蛋壳膜孔隙度图像处理过程（2 000×）Fig. 6 Original and Image J processed images showing eggshell membrane porosity (2 000 ×)

由图7可知，随着腌制时间的延长，3 组蛋壳膜内膜及外膜孔隙度均呈现出波动变化的趋势。原料蛋新鲜度越低，蛋壳膜的孔隙度越高，蛋壳外膜孔隙度均高于同组蛋壳内膜孔隙度，A组蛋壳膜孔隙度在腌制全周期均为最小，B组与C组之间差异较小。原因可能是A组皮蛋的哈夫单位与蛋黄指数均与C组之间存在显著性差异（P＜0.05），而B、C组的蛋黄指数之间无显著差异（P＞0.05）（表1）。同时，第0天时，C组不新鲜蛋的蛋壳内外膜孔隙度均显著高于A组（P＜0.05），可能更有利于腌制液渗透入蛋内，从而导致在腌制过程中碱液对于蛋壳膜纤维茎杆的腐蚀更为剧烈。因此，在腌制过程中，A组与C组的蛋壳内膜及外膜孔隙度之间均存在显著性差异（P＜0.05），B组与另两组之间的差异性随腌制过程的推进存在变化，在腌制后期内膜外侧孔隙度差异更明显。

图7 不同新鲜度原料蛋在皮蛋腌制过程中蛋壳内膜及外膜孔隙度的变化趋势Fig. 7 Changes in the porosity of inner and outer shell membranes of raw eggs with different freshness during the curing of preserved eggs

2.6 原料蛋新鲜度对腌制期间皮蛋品质整体的影响

表2为使用Pearson相关性分析法对实验结果进行分析，对3 组皮蛋在腌制过程中蛋壳膜的外膜内侧、内膜外侧孔隙度与凝胶质构参数（硬度、弹性）及内容物理化性质（凝胶pH值、含水率）之间的相关性进行分析。

随着碱液与皮蛋内容物发生作用，自腌制第8天皮蛋凝胶开始形成[27]，随着凝胶含水率下降、蛋壳内膜及外膜孔隙度上升，凝胶的硬度与弹性逐渐升高。由表2可知，凝胶的含水率与硬度之间存在显著负相关关系（r＝-0.463）（P＜0.05），蛋壳内膜与外膜的孔隙度均与凝胶的硬度及弹性存在正相关关系（P＜0.01、P＜0.05），可能由于蛋壳膜茎秆之间的孔隙作为腌制液渗透入蛋内的通道，可有效影响腌制液与皮蛋内容物相互作用，从而控制凝胶品质。同时，原料蛋新鲜度与蛋壳膜内膜及外膜孔隙度呈现极显著负相关关系（r＝-0.702、r＝-0.714）（P＜0.01），且同新鲜度蛋壳内膜与外膜孔隙度之间具有极显著正相关关系（r＝0.936）（P＜0.01）。研究表明，孔隙度在一定程度上可以表征蛋壳内部与外界交换通道的数量，在贮藏期间蛋内的CO2及水分会从透过蛋壳及蛋壳膜向外逸散，因此造成质量损失[24]。因此，推测蛋壳膜会随皮蛋内容物一起产生水分散失，使得茎秆之间的纤维交织不再致密，造成3 组皮蛋孔隙度之间出现差异，孔隙度与原料蛋新鲜度之间呈负相关关系。

表2 蛋壳膜超微结构参数、原料蛋新鲜度、质构参数与内容物理化指标的相关性分析Table 2 Correlational analysis between eggshell membrane ultrastructure parameters, raw egg freshness, texture parameters and physical indexes

腌制中期，通过碱液的不断渗透腐蚀作用，蛋壳腐蚀孔逐渐形成，此时碱液更易进入蛋内，使得腌制中期皮蛋凝胶的pH值产生变化（图2）。随着腌制时间的延长，腌制液中的金属离子在蛋壳表面产生附着作用，使得碱液难以进入蛋内，并产生“堵孔”作用，进一步抑制碱液的渗透。同时，腌制液中的金属盐硫酸铜可能与蛋白质分子产生聚合作用形成凝胶网络结构[28]，且pH值与凝胶硬度存在显著负相关关系（r＝-0.459）（P＜0.05），使得腌制中期凝胶的硬度和弹性产生波动变化。

由图2可知，腌制后期凝胶中的pH值下降趋势加剧，Sun Naxin等[29]研究发现腌制过程中部分碱液会渗透入蛋黄内部，且第33天时皮蛋进入贮藏期，碱液不再渗透入蛋内，含水率持续降低，待蛋内体系平衡稳定后，凝胶的硬度及弹性又呈现升高的趋势。

皮蛋凝胶是变性的蛋白质分子间或其与溶剂分子之间排斥和吸引相互作用力相平衡的结果[28]，形成和维持蛋白凝胶网络的作用力主要包括疏水作用、氢键、静电作用以及二硫键等。有研究表明，卵白蛋白的降解过程是导致蛋清水样化的因素之一，卵白蛋白分子中的α-螺旋和β-折叠结构含量下降，使得卵白蛋白的分子结构在贮藏期间逐渐变得松散、无序[30]。因此，原料蛋新鲜度降低导致蛋清水样化，使得蛋白质分子变得松散无序，且在贮藏过程中，伴随着蛋黄脂质的水解及氧化，使不新鲜蛋在碱诱导下更易形成凝胶，从而产生原料蛋新鲜度越低，皮蛋成品凝胶质构硬度及弹性越高的现象。

通过菌落计数实验发现3 组皮蛋在腌制完成后成品皮蛋内部均无细菌存在，可能由于蛋内pH值较高，导致微生物难以存活。同时，3 组皮蛋的成品率分别为91.25%、83.75%、62.50%，C组的成品率极低且蛋壳表面黑斑较多。研究表明，蛋品在室温下贮藏期间，前16 d新鲜度显著下降，且贮藏时间超出20 d的蛋品不再具有食用价值，因此不宜作为原料蛋进行腌制[31]。本实验选取3 组不同新鲜度鸭蛋作为实验原料仅用于控制新鲜度梯度，探寻腌制期间皮蛋品质变化规律及原料蛋的新鲜度对腌制期皮蛋品质的影响。

本研究以不同新鲜度原料蛋在相同条件下进行腌制，结果表明，原料蛋新鲜度越低则达到同一皮蛋成品凝胶品质的腌制时间越短，成品蛋A组与C组的凝胶品质及蛋壳膜孔隙度均具有显著性差异，且随着原料蛋的新鲜度变化各指标的变化幅度存在差异，间接说明皮蛋的品质与原料蛋的新鲜度之间具有密切关系。

3 结 论

本研究探寻了不同新鲜度原料蛋在腌制过程中不同指标之间的差异性，发现腌制过程中蛋壳膜超微结构与皮蛋凝胶品质之间具有紧密联系，原料蛋新鲜度越低，腌制液更易渗透入蛋内促进凝胶形成。因此在相同皮蛋成品要求条件下，原料蛋新鲜度越低，腌制时间越短，但原料蛋新鲜度降低的同时会导致皮蛋成品率显著下降，造成经济损失，且贮藏时间超出20 d的蛋品不再具有食用价值，因此不宜作为原料蛋腌制皮蛋。本实验对皮蛋加工过程中的质量控制和皮蛋蛋壳膜超微结构等的研究具有一定参考意义。