陈莹莹, 白礼涛, 刘 抗, 李强明, 罗建平, 查学强

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

薄荷油(peppermint oil,PO)是一种呈薄荷香味的无色或淡黄色澄清液体,具有祛除异味,防腐、抑菌及驱虫等功效,常添加在糖果、糕点等加工食品、饮料、化妆品中,尤其是运用其抗菌和抗真菌活性作为食品防腐剂在食品中广泛应用[1]。由于其沸点低、易挥发、不溶于水、生物利用率低，极大程度地阻碍了其在食品领域中的应用[2]。因此,基于成本效益低、生物相容性好、易于制备等特点,开发一种水包油乳液的输送系统,从而提高PO的水溶性及生物利用率是目前被广泛研究的热点。

近年来,水包油型乳液被广泛用于包埋疏水性生物活性物质,在化妆品、制药和食品工业都有广泛应用[3]。乳液主要可根据其粒径分为普通乳液(>200 nm)和纳米乳液(50～200 nm)[4]。纳米乳液因其纳米级粒径而具有极高的表面活性和吸附性,常用于构建营养素的递送体系。同时,纳米乳液被认为是一种近热力学稳定体系[5],在其贮藏过程中不会出现聚集、絮凝、沉淀、奥氏熟化等现象[6]。

本文以乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)和莲藕支链淀粉(lotus root amylopectin,LRA)通过干热反应偶联得到的复合物WPI-LRA作为乳化剂,高压均质制备稳定的水包油型PO纳米乳液,研究不同油相比、芯壁比(CWR),对乳液粒径、储存稳定性的影响以及纳米乳液抑菌特性的测定。

1 材料与方法

1.1 材料

无花藕(合肥大兴农产品批发市场);薄荷油(苏州嘉叶生物科技有限公司);异丙醇、乙醇、异辛烷(国药集团化学试剂有限公司);甲醇(西陇化工股份有限公司);超纯水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.2 仪器

79HW-1恒温磁力搅拌器(常州国宇仪器制造有限公司);FD-1D-80真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);AL104电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);Nano-Zs90型纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国Malvern仪器公司);DHG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

(1) WPI-LRA复合物乳化剂的制备。称取质量比固定的WPI与LRA粉末相混合,完全溶解在蒸馏水中,冷冻干燥。收集冷冻干燥后得到的粉末,放置在底部盛有饱和KI溶液的干燥器中反应13.6 h,得到WPI-LRA复合物[7],待使用前,样品一直存放在4 ℃冰箱。

(2) 乳液的制备。WPI-LRA复合物在水中分散后不断搅拌(3 h),得到乳化剂水相溶液(质量分数为1%)。纯PO、不同体积比的PO与大豆油(soybean oil,SO)(1∶5、1∶1、5∶1)分别作为油相。乳化剂水相溶液与油相混合后,经高速均质(20 000 r/min,1 min)得到粗乳液,再分别在10、40、70、105 MPa的高压下均质1～7次从而得到粒径不同的乳液[8]。高压均质制备样品时,通过设定15 ℃的冷却水系统温度来控制均质阀和样品出入口的温度。

(3) 乳液粒径的测量。乳液经浓度为8 mmol/L、pH=7.0的磷酸缓冲液稀释至半透明状态,从而可以避免多次散射效应。使用动态光散射仪(dynamic light scattering,DLS)在室温下测定乳液的平均粒径。

(4) 乳液微观结构的表征。在载玻片上分散少量新鲜制备的乳滴,使用普通光学显微镜(400倍)观察其形态并拍照。

(5) 实验菌悬浮液的制备。经固体培养基挑取金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii),并接种到LB肉汤液体培养基上。醒菌24 h使其活化后,再分别取1% 的金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌于新鲜的LB中备用。

(6) 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定。首先加入经灭菌处理后的LB液体培养基100 mL置于锥形瓶中,然后向锥形瓶中分别加入6.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mL的PO和PO纳米乳液,再分别加入金黄色葡萄球菌或阪崎肠杆菌悬浮液1 mL,在保温箱中培养10 h后,观察锥形瓶中液体的浑浊情况[9]。

(7) 菌落生长曲线的测定。为了测定金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌2种细菌在纯PO和包埋PO的纳米乳液的生长情况,菌落悬浮液经培养75 h,每隔一段时间取2 mL液体于比色皿中,利用紫外分光光度计测定OD600值。

1.4 数据分析

所有实验均重复3次,数据取(平均值±标准差),采用SPASS数据处理软件对实验数据进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 油相对乳液粒径的影响

2.1.1 均质压力对乳液粒径的影响

本文以PO作为油相,分析不同均质压力及均质次数对乳液粒径的影响。首先配制质量分数为1%的WPI-LRA乳化剂水相溶液,再将PO分散在WPI-LRA乳化剂水相溶液中,使其质量分数为10%。并分别在10、40、70、105 MPa的高压下均质7次得到乳化液。利用动态光散射仪测定不同均质压力及不同均质次数下的乳化液的平均直径。不同均质压力下乳液的微观结构如图1所示,从图1可以看出，乳液粒径随着均质压力的增大而增大,这可能是由于这类精油物质自身特性导致的。文献[10]研究表明装载2种不同精油时,液滴尺寸也表现出相同的趋势。这种现象可以用奥氏熟化(Ostwald ripening)理论解释,由于油的易扩散性,小液滴汇集成大液滴从而导致平均粒径增大[11]。

图1 3种不同均质压力下乳液的微观结构

2.1.2 均质次数对乳液粒径的影响

本文以混合油相作为油相,研究在不同均质次数下制备得到的乳液粒径的变化情况。首先,SO和PO以不同比例混合,再将混合油相分散在质量分数为1% 的WPI-LRA乳化剂水相溶液中,在105 MPa下进行高压均质，测定的粒径结果如图2所示,从图2可看出,当SO体积比逐渐增大且均质次数逐渐增多到7次时,乳液粒径可以达到纳米级。文献[12]的研究结果与本文一致,向油相中添加一些水不溶性成分(如SO)时,可以有效抑制出现奥氏熟化现象。SO因其极性较低、密度较高、黏度大的特性常被广泛用于增溶剂或载体溶剂,从而提高色素、精油、香料、维生素等物质的生物利用率。

图2 均质次数对乳液粒径的影响

2.2 混合油相对乳液黏度和粒径的影响

混合油相成分对乳液黏度和粒径的影响如图3所示。从图3可以看出,不同比例的混合油相对乳液的粒径和黏度有很大的影响。随着SO体积分数的增加,粒径逐渐减小,黏度呈现上升的趋势，当SO体积分数达到20%时,与纯PO为油相制备的乳液相比,粒径从1 592 nm减小到310 nm，随着SO体积分数继续升高,粒径小幅减小。同时,随着SO体积分数的增大,乳液的黏度由25.6 mPa·s增加到45.1 mPa·s。SO体积分数对液滴粒径和黏度的影响趋势与文献[13]的报道一致。经分析,液滴的直径会极大程度地影响乳液的流变行为[14]。在同一剪切速率下,粒径的减小会使黏度升高。降低的粒径和提高的黏度有益于提高乳液的稳定性。综上所述,使用经PO和SO组成的混合油相可以有效抑制纯PO发生奥氏熟化。

图3 混合油相对PO乳液粒径和黏度的影响

2.3 CWR对乳液粒径和多分散系数的影响

CWR指芯材与壁材之间的质量比,其对乳液包载效率有很大影响。乳液在工业制备过程中,CWR与负载营养素的含量呈正相关趋势,有益于提高工厂的效益。但CWR也不能无限度增大,由于负载过量的营养素或药物时,极易导致絮凝或凝聚等现象发生,从而使得乳液的物理化学性质发生相应变化。只有选择合适的CWR,才可以制备出合适的乳液。因此,本研究以质量分数为1%的WPI-LRA为乳化剂,SO和PO为混合油相,均质压力为105 MPa的条件下,分析不同芯材载量对乳液粒径和多分散指数(polydisperse index,PDI)的影响,从而探究制备乳液最合适的CWR,结果见表1所列,由表1可知，当CWR由1∶3升高到3∶3时,乳液的粒径只有略微的改变,随着CWR升高到4∶3时,乳液粒径由182 nm升高到251 nm。主要原因在于油相比过大时,导致乳化剂并没有被完全乳化而出现了悬浮,营养素没有被完全包载。文献[15]指出,可以根据PDI值的大小判断乳液的分散情况与均一性，较小的PDI值表明乳滴分散集中,粒径分布较窄,乳液均一性好。由表1可知,CWR为3∶3时制备的乳液的粒径和PDI值均最小,说明这是最适宜制备乳液的CWR值。

表1 不同CWR对乳液粒径和PDI的影响

2.4 乳液储藏稳定性分析

30 d内乳液粒径的变化如图4所示。

图4 储藏时间对30 d内乳液粒径变化

从图4可以看出,乳液的粒径会随储藏时间(1、15、30 d)的变化而发生相应改变,并且不同油相比(1∶5、1∶1、5∶1)制备的乳化液粒径均呈现出逐渐增大的趋势。V(PO)∶V(SO)为1∶5时,储藏30 d后乳液的粒径从176 nm增加到260 nm；V(PO)∶V(SO)为1∶1时,储藏30 d后乳液的粒径从205 nm增加到319 nm,而V(PO)∶V(SO)为5∶1时,储藏30 d后乳液的粒径从210 nm增加到344 nm。由此可以看出,PO体积比较高的油相制备的乳液的初始粒径和最终粒径都相对较大,且储藏过程中略微出现了油滴悬浮的现象。

2.5 乳液的抑菌特性分析

2.5.1 最低抑菌浓度分析

最低抑菌浓度(MIC)指能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。本文测定的MIC指制备的PO乳液抑制金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌生长繁殖的最低浓度。乳液抑菌结果分析见表2所列。表2中：+表示加入该物质；-表示未加该物质。从表2可以看出,纯PO与PO乳液对金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌2种菌株的MIC均为0.50%,说明与纯PO相比,纳米乳液乳化体系对这2种菌株的抑制效果一致,并不会改变薄荷油的抑菌能力。原因在于纳米乳化体系可以有效保护包埋的营养物质,阻止其出现氧化或挥发。文献[16-17]研究结果与本文结果一致。

表2 乳液抑菌结果

2.5.2 菌落生长曲线分析

通过将金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌与最低抑菌浓度的PO和纳米乳液包埋的PO共同培养,观察在75 h内对生长曲线的影响,从而测定其对这2种菌株生长情况的影响。培养测定时间主要分为以下4个阶段：缓慢生长期(0～5 h)；快速生长期(5～18 h)；稳定期(18～20 h)；凋亡期(20～45 h)。菌落的生长曲线如图5所示,由图5可知,单纯乳液组处理的金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌的OD600曲线十分相似,表明单纯乳液并没有抑制细菌的生长，2种菌株对PO和PO纳米乳液的敏感程度不同,表现为其OD600在不同时间达到最大值,且其最大值也不同;PO处理的阪崎肠杆菌在18 h时达到最大值0.875,而经PO乳液处理的阪崎肠杆菌在12 h就达到最大值0.788。对于金黄色葡萄球菌,经PO处理与PO纳米乳液处理时,OD600均在12 h时达到最大值,然而PO组的OD600值为0.900,PO纳米乳液处理时的OD600最大值为0.778。因此,不同菌属经PO乳液处理的OD600值均小于纯PO组。

虽然纯PO和PO纳米乳液对2种菌株的MIC相同,但PO纳米乳液更能抑制2种菌株的生长,表现出持续更长时间的抑菌能力。主要是PO经纳米乳液包埋后,一方面是由于纳米级粒径降低了乳液的传质阻力,有利于菌株被动吸附PO,因而PO的抑菌能力有所提高;另一方面由于纳米乳化体系可以保护PO的有效生物活性成分,且提高了PO的溶解度和理化稳定性,增大了生物活性成分与微生物的作用几率,从而得以延长抑菌时间[18]。

图5 菌落的生长曲线

3 结 论

PO和SO组成的混合油相可以有效抑制发生奥氏熟化现象。当PO与SO的体积比为1∶5时,经高压均质7次后,可以得到粒径为176 nm的纳米乳液。设定CWR为3∶3时,制备得到的乳液粒径和PDI均较小,为最合适的CWR。乳液储藏稳定性实验结果表明,不同PO与SO体积比的混合油相制备的乳液粒径均随储藏时间的延长而增大,而且PO体积比越高的油相制备的乳液初始粒径和最终粒径都相对较大,并且储藏期间出现了油滴悬浮现象。通过测定MIC可知，纯PO和经纳米乳液包埋的PO的MIC相同，然而比较2种菌株恒温培养 75 h 的生长曲线可知,PO纳米乳液具有比PO持续时间更长的抑菌能力,即由WPI-LRA包埋PO的纳米乳液具有时效更长的抑制微生物生长特性。