陈柯君，叶茜，方圣

(重庆医科大学附属第一医院皮肤科，重庆 400016)

皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是皮肤恶性程度最高的一种皮肤肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，虽然CMM在皮肤肿瘤中仅占5%，但其病死率占皮肤肿瘤的70%[1]。目前CMM的治疗方法包括早期手术扩大切除、术后干扰素注射、新型靶向治疗、免疫治疗等，但部分黑色素瘤仍会出现转移及局部复发，特别是对于已转移的黑色素瘤，其预后极差。而热激蛋白(heat shock proteins，HSPs)作为一种分子伴侣，在维持蛋白质的正确表达、细胞生长发育等方面发挥重要作用。其可以促进受控的细胞生长，避免凋亡，提高细胞存活率，并促进血管生成，而这种功能对于许多恶性肿瘤增殖、转移不可或缺[2]。既往研究表明，在多种肿瘤(如结直肠癌、肺癌和口腔鳞状细胞癌)中，HSPs的表达水平升高，大多数情况下表达水平升高预示预后较差[3]。由于HSPs与肿瘤关系密切，与HSPs相关的肿瘤疾病可称为“伴侣病”。既往有文献报道，与良性色素痣相比，CMM中HSP70/90/105表达水平明显升高[4-6]。因此，HSPs可能成为鉴别良恶性肿瘤的新型标志物，也可能作为新型的肿瘤治疗方法。现就HSPs与CMM研究进展予以综述。

1 HSPs的生物学功能

HSPs在生物界普遍存在，从原核生物到真核生物均有HSPs的表达。作为一种急性反应蛋白，在正常情况下，其表达水平较低，但当机体受到高温、缺氧、病毒、感染、紫外线照射等刺激时，会合成HSPs来保护机体，提高细胞的应激能力。伴侣蛋白不仅存在于组织，也可作为细胞分泌的产物存在于体液，且细胞内外均有HSPs的表达[7]。HSPs主要协助蛋白质的折叠和再折叠，降解错误折叠的蛋白质，同时也参与体外作用，如参与免疫系统调节、细胞分化、基因表达、DNA复制、信号转导、程序性细胞死亡、细胞衰老等。依据分子量不同，HSPs可以分为5类，分别为小分子HSPs、HSP40、HSP70、HSP90及HSP105/110，其中HSP105/110是一种主要的哺乳动物HSPs，是HSP70家族的一个不同亚群[3]。

HSPs不仅在正常细胞中发挥作用，也参与肿瘤细胞的存活、增殖及转移，其发病机制主要包括以下几个方面：①肿瘤的无限增殖为其主要特性，而控制无限增殖的许多信号蛋白均为HSPs的客户蛋白，因此HSPs的增加是肿瘤无限增殖的信号通路的基础。另外，HSP90可抑制肿瘤细胞中端粒酶的活性，从而阻止端粒的缩减[2,8]。②由于肿瘤细胞增殖速度较快，蛋白需求量大，不可避免出现错误折叠，因此肿瘤细胞劫持了HSPs的保护功能来满足肿瘤折叠需求的增加。③HSPs可协助肿瘤逃避细胞的程序性细胞死亡，如HSP27通过抑制凋亡蛋白Bid，HSP70通过抑制线粒体膜上的Bcl-2相关蛋白，从而抑制凋亡前蛋白的释放。在线粒体的下游，HSP27通过与细胞色素C结合，而HSP70和HSP90与凋亡蛋白酶激活因子1结合，从而阻止胱天蛋白酶的激活和凋亡。④HSPs也可促进肿瘤血管的生成，如HSP27不仅可与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)结合促进肿瘤血管生成，还可诱导缺氧因子生成，加快肿瘤毛细血管网的生长[2]。⑤HSPs可促进肿瘤的侵袭和转移。作为客户蛋白，HSP90可协助黏着斑激酶、整合素连接激酶和酪氨酸受体激酶ErbB2及原癌基因MET的合成，从而使肿瘤更易转移[2]。因此，HSPs与肿瘤的关系十分密切，且这一类伴侣蛋白也可成为病因或致病因素，形成致病性蛋白。研究表明，HSPs的过表达与多种肿瘤有关，包括前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、食管鳞癌、肾细胞癌等[2,9]。目前，HSPs抑制剂是研究热点，未来可根据HSPs相关机制研究，进一步研制出相关药物用于肿瘤的治疗。

HSPs也具有免疫原性，其可通过活化自然杀伤细胞、激活单核巨噬细胞系统等，引发固有免疫反应。另外，HSPs多肽复合物也可通过主要组织相容性复合体Ⅱ途径来诱导CD4+T淋巴细胞的固有免疫反应[10-11]。HSPs多肽复合物主要有以下两方面的作用：①作为多肽(包括抗原性肿瘤多肽)的伴侣，激活抗原特异性适应性免疫。②作为抗原呈递细胞的佐剂，独立于任何相关肽，促进先天免疫反应。因此基于其免疫原性，目前已有研究将HSPs作为基础疫苗与免疫调节性单克隆抗体(如抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4和抗程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1)协同使用治疗肿瘤[12]，且HSPs疫苗已成功应用于多种肿瘤(如黑色素瘤[11]、转移性结肠癌[11]和胶质母细胞瘤[13])，并显示出极好的安全性。综上可知，HSPs作为分子伴侣既有促进肿瘤生长的作用，也可激活自身免疫起到治疗肿瘤的作用。

2 不同类型的HSPs与CMM的关系

CMM是一种源自皮肤黑色素细胞的恶性肿瘤。早期通过手术切除原发肿瘤可完全治愈，但转移性CMM患者预后较差。目前对于已转移的患者，可选择手术切除原发灶及淋巴结清扫，术后予以大剂量干扰素注射预防复发[12]。而HSPs作为新型治疗方案为CMM患者治疗提供了新选择。以下分别介绍不同种类HSPs对CMM的影响。

2.1小HSPs与CMM HSP27是一种小HSPs，其通过管理错误折叠的蛋白和防止细胞凋亡来维持细胞在应激条件下的生存[14]。此外，HSP27在血管生成、肿瘤细胞迁移、抑制肿瘤凋亡以及细胞骨架组织中发挥重要作用。研究表明，HSP27与肿瘤相关，如在早期(Ⅰ期和Ⅱ期)结直肠癌中HSP27表达水平降低，而在晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)及肺转移结直肠癌患者中HSP27表达水平升高[15]，在口腔鳞状细胞癌[16]患者中HSP27表达水平最高。然而，HSP27与胃癌、肝癌的预后无明显相关性[17-19]。CMM在增殖时需要丰富的血供，而HSP27与血管生成密切相关。研究显示，血管生长因子依赖HSP27的调控，在CMM中下调HSP27可使VEGF及碱性成纤维细胞生长因子分泌减少，而敲除HSP27后，涉及血管生成相关的转录因子表达明显减少[2，19-20]。有研究表明，在HSP27表达水平较高的转移性CMM患者中，靶向抑制VEGF的药物贝伐珠单抗的疗效更佳[21]。但目前关于HSP27与CMM的研究较少，HSP27促进肿瘤组织血管生成仍需要进一步研究，需要检测多个反映血管新生的指标，如微血管密度、增殖微血管密度、血管增殖指数等。另外，也有HSP27抑制剂运用于临床试验。

2.2HSP70与CMM HSP70的含量十分丰富，与其他HSPs功能类似，其具有协助大量蛋白质折叠、协助错误蛋白质降解等作用[22]。研究发现，HSP70在多种肿瘤(如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、CMM)中均高表达[4，23]。而HSP70促进CMM发生的机制可能包括：①HSP70可抑制胱天蛋白酶依赖的线粒体介导的内、外源性凋亡途径，也可与促凋亡因子(凋亡诱导因子)结合抑制独立凋亡通路，从而促进肿瘤的生长。②HSP70可与抑癌基因p53结合后抑制信号转导，使肿瘤细胞逃脱死亡，促进细胞的存活。另一方面，HSP70能够与肿瘤特异性抗原组成多肽复合物激活T、B淋巴细胞，从而引发一系列特异性免疫应答，同时也可激活固有免疫应答[24]。临床研究表明，HSP70在黑色素瘤中过表达，其中CMM转移病灶中的表达水平最高，但在色素痣、正常细胞及组织中表达较少[24]；另外，HSP70表达水平与Clark水平存在相关性，对预后判断具有重要价值[4，25]。但有研究认为，HSP70在色素痣、CMM、正常皮肤中的表达未见明显区别[26]，因此其作用仍有待进一步研究明确。此外，HSP70阳性/MEL-5阴性的标记组合可用于评估CMM的转移潜能，同时也可作为预后危险因素的指标[4]。

近年来，HSP70在肿瘤治疗中的应用越来越广泛。依据致病机制，其治疗方法主要包括以下两种：①靶向治疗。目前已有多个HSP70抑制剂，主要靶向N端结构域和C端结构域，包括天然产物和合成小分子[27]。研究发现，肿瘤细胞表面出现HSP70家族的基因编码的蛋白质，并携带免疫原性物质，因此更易成为抗体治疗的靶点[28]。另有研究表明，HSP70抑制剂PET-16可降低磷酸化黏着斑激酶及突变基因BRAF的表达水平，从而阻断肿瘤的迁移、侵袭和转移。因此，HSP70抑制剂与BRAF抑制剂可协同作用，在一定程度上增加黑色素瘤对BRAF抑制剂的治疗效果[29]。②免疫治疗。有研究表明，使用HSP70水凝胶合成物外用或直接瘤内注射于黑色素瘤小鼠可在激活CD4+、CD8+T细胞和自然杀伤细胞的同时产生强烈的免疫反应，从而发挥抗肿瘤作用[30]。另外，HSP70疫苗与sBTLA基因转染的腺相关病毒联合使用激活免疫应答，可缩小CMM小鼠肺转移灶，延长小鼠的生存时间[31]。未来进一步明确HSP70在黑色素瘤中的作用机制对肿瘤的预防和治疗均具有重要意义。

2.3HSP90与CMM HSP90是目前研究最多、依赖ATP的分子伴侣，参与数百种蛋白质的适当折叠和成熟。其可以分为HSP90α、HSP90β、肿瘤坏死因子受体相关蛋白1及葡萄糖调节蛋白94四种不同的亚型[32]。研究显示，HSP90在黑色素瘤中的表达水平高于痣，且表达水平随着Clark分级升高及Breslow深度增加而增高，但HSP90的高表达与生存率之间无明显相关性[5]。另外，CMM患者血清中的HSP90水平明显高于健康对照者，表明血清HSP90可能是CMM进展的生物标志物[33]。CMM的发生发展主要依赖促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、BRAF、核因子κB、Wnt/β联蛋白等信号通路，而这些通路中的关键蛋白均是HSP90的客户蛋白[34]。因此，HSP90在CMM的增殖、分化、转移、调节细胞周期、血管生成等方面发挥重要作用[35-37]。与HSP27和HSP70类似，HSP90也可通过调控p53、核因子κB、蛋白激酶B、Raf-1、c-Jun氨基端激酶等多种凋亡因子在细胞凋亡中发挥重要作用[2]。有研究表明，HSP90抑制剂可通过降解缺氧诱导因子-1α抑制下游VEGF的表达，抑制肿瘤血管生成，从而在CMM血管生成中发挥作用[38]。

此外，黑色素瘤细胞表面也发现了HSP90表达增加，提示HSP90是一个潜在的免疫相关靶点[39]。因此，已有很多选择性HSP90抑制剂靶向用于肿瘤治疗，其中HSP90靶向C端的抑制剂有新生霉素及其衍生物；N端抑制剂有苯醌类、间苯二酚类抑制剂，包括格尔达霉素、17-丙烯氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)、根赤壳菌素等；靶向中间结构域的抑制剂有Sansalvamide A及其衍生物[34]。由于HSP90在信号转导、细胞周期控制和凋亡的调节中发挥重要作用，同时可以从多环节、多途径影响癌细胞生长和存活，避免了单靶点治疗可能产生的耐药性，所以HSP90在CMM的靶向治疗中具有良好的应用前景。对于BRAF v600突变黑色素瘤患者，虽然初始使用BRAF抑制剂时效果较佳，但会出现耐药现象，而有临床试验表明，使用HSP90抑制剂XL888联合维莫非尼治疗基因突变患者疗效时间增加，且不良反应可耐受[40]。目前，热消融或激光治疗较大的CMM可能引起局部复发，而使用HSP90抑制剂(17-DMAG)可以增强高温条件下黑色素瘤细胞的凋亡效应，通过蛋白激酶B和p38促分裂原活化的蛋白激酶途径降解HSP90，抑制SK-MEL-2黑色素瘤细胞的生长，促进细胞凋亡。因此在高温状态下，使用HSP90抑制剂可能是黑色素瘤的一种辅助治疗方法[41]。有研究表明，HSP90抑制剂17-AAG外用能有效预防紫外线诱导的表皮增生和鳞状细胞癌，考虑17-AAG可配制成乳膏用于预防紫外线暴露人群或器官移植人群的皮肤鳞状细胞癌[42]。因此，HSP90抑制剂的运用可能拓宽CMM的治疗途径。

2.4HSP105与CMM HSP105是一种大分子量蛋白，具有多种功能，如防止蛋白质错误折叠过程中的聚集，提供细胞耐热性以及稳定热变性蛋白质，目前有关HSP105在黑色素瘤中的作用研究较少[43]。HSP105可以保护细胞免于凋亡，对癌细胞的生存和增殖至关重要。HSP105在多种人类癌细胞中均有过表达，而其在鳞状细胞癌[44]、肺腺癌[45]、口腔鳞状细胞癌[46]中的过表达与疾病进展和不良预后有关。有研究表明，乳腺癌、直肠癌及CMM临床研究中HSP105过表达的患者总体生存期短[47]。但HSP105过表达与膀胱癌的良好预后相关[48]。在皮肤肿瘤中，HSP105在乳房外佩吉特病、鳞状细胞癌中高表达，在基底细胞癌中表达较少[49]。在正常人皮肤、良性黑色素细胞、色素痣中HSP105几乎不表达，然而在原发、晚期及转移的CMM中HSP105高表达。有研究表明，与HSP70相比，HSP105被认为是与CMM相关性更强的肿瘤相关抗原[6]。

此外，HSP105也在肿瘤生长方面发挥作用，如Wnt/β联蛋白信号通路在结肠癌等肿瘤中可发挥重要作用，β联蛋白分子在细胞质中的累积，可引起细胞核内异常基因的转录，而HSP105可促进β联蛋白分子的累积和核内基因表达，从而促进肿瘤的增殖、分化。另有研究表明，在抑制凋亡方面，HSP105不仅可通过抑制Bcl-2相关X蛋白转位到线粒体，从而阻止细胞色素C的释放，还可使蛋白激酶通路中的p38表达减少[3]。因此，HSP105可以抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤的持续克隆增殖。

HSP105是高效的分子伴侣，具有强大的多肽结合力，其效率为HSP70的40倍[50]。目前，已有多种HSP105多肽复合物疫苗、干扰小RNA进行试验并取得一定成效。如用HSP105 DNA疫苗免疫小鼠，可使适应免疫中的CD4+T及CD8+T细胞激活，从而激活免疫系统对抗肿瘤(如结直肠癌和黑色素瘤)，但这种疫苗却不会引起自身免疫[51]。有学者对HSP105疫苗进行Ⅰ期临床试验发现，HSP105可诱导细胞毒性T细胞反应激活免疫反应[52]。因此，HSP105疫苗有望成为治疗CMM的新方式。目前关于HSP105与CMM的研究较少，但其能够作为优势的免疫佐剂研发抗肿瘤疫苗，因此需要深入研究HSP105在CMM发生发展中的相关作用机制。

2.5其他类型HSPs与CMM 目前，关于其他类型的HSPs与CMM的研究较少。HSP40家族分布于不同细胞器，并在蛋白质的翻译、折叠、转运和降解等过程中发挥重要作用。HSP40的J结构域负责与HSP70相互作用，作为分子伴侣存在，两者常共定位于相同的亚细胞区域，HSP40在HSP70活性调节中起着关键作用[53]。HSP40预先识别要转移到HSP70的底物，并刺激HSP70的ATP水解，从而使得底物与HSP70稳定结合，因此HSP40-HSP70的相互作用可能对肿瘤的治疗具有重要意义，可为药物定位或免疫疗法提供可行目标，但HSP40在CMM中的相关作用机制尚不明确，仍需进一步研究。HSP60是重要的应激蛋白，其广泛存在于原核细胞和真核细胞，具有高度保守性和序列同源性。HSP60参与应激反应中蛋白质合成、多肽折叠、受损线粒体蛋白运输等生理过程，且具有免疫原性和免疫调节功能。HSP60表达水平的变化可为肠癌、胃癌等肿瘤的早期发现、流行病学调查提供依据[54]。研究表明，用HSP65免疫小鼠可激发免疫反应，抑制小鼠黑色素瘤生长，延长肿瘤小鼠的生存时间[55]。

3 小 结

既往研究表明，HSPs家族中的HSP70、HSP90和HSP105在CMM中均呈高表达，且其高表达常与预后较差有关[56]。同时，HSPs的表达水平升高可促进CMM的增殖、转移以及血管生成。目前,肿瘤的免疫及靶向治疗是研究热点，而HSPs具有双重调节作用，不仅能够激活免疫系统，也有抗凋亡作用。在治疗方面HSPs能够刺激天然免疫、细胞免疫和体液免疫应答起到治疗作用，而靶向使用HSPs抑制剂辅助其他靶向药物，可预防耐药性。但HSPs与CMM关系密切，未来通过不断研究可为后续CMM的诊断、差异性治疗提供新方向。