陈娜 陈文燕 崔恩海

新冠病毒感染后，免疫系统被过度激活时会生成大量的炎症因子，导致严重的细胞因子风暴。细胞因子风暴可导致肺及多器官损伤，继而出现肺水肿、换气功能障碍、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、急性心脏损伤和继发感染，最终导致患者死亡。间充质干细胞(MSCs)是一类多潜能组织干细胞，在抗炎、再生、免疫调节等方面有着巨大潜力，能够通过直接接触或旁分泌多种细胞因子的方式调节免疫，适时抑制过激免疫反应，抑制细胞因子风暴，同时具有促进损伤组织恢复的能力。MSCs静脉输注在治疗急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、重症肺炎上已被证实具有良好的安全性和有效性，在治疗新型冠状肺炎的临床试验也已经广泛开展。本文就MSCs用于控制新冠肺炎细胞因子风暴的情况作出综述，提供进一步临床研究参考信息。

对新冠肺炎的炎症因子风暴与间充质干细胞治疗可行性认识

自去年12月以来，新型冠状病毒(COVID-19)在全球传播迅速，造成了毁灭性的大流行，严重危害人们的健康。新型冠状病毒肺炎，简称为“新冠肺炎”，轻者可表现为急性自限性症状，如发热、乏力、干咳、流涕等，重者可出现急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)、脓毒症休克、出凝血功能障碍以及多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)甚至死亡等[1]，目前尚无确切效果的可用于治疗和控制COVID-19的预防性疫苗或有效抗病毒药，主要采用对症和支持疗法。COVID-19具有独特的免疫病理学[2]，重症COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量常显著减少，部分患者免疫系统因感染、药物、自身免疫疾病等因素过度激活时，免疫细胞就会应激过度，产生过多的细胞因子会导致正反馈循环从而出现细胞因子风暴综合征(Cytokine Storm Syndrome，CSS)，开始促炎性细胞因子(IFN-α，TNF-γ，IL-1β，IL-6，IL-12，IL-8，IL-33)和TGF-β的分泌增加，进而发展为急性呼吸窘迫综合征，全身性炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome , SIRS)，多器官功能障碍综合征，导致全身性衰弱性疾病患者的死亡率增加。HUANG等[3]在SARS-CoV-2感染病例首批临床数据中的危重病人中可见细胞因子风暴的发生。细胞因子风暴是新冠肺炎患者轻症向重症和危重症转换的一个重要节点，有助于新冠肺炎的临床分型以及预测发展的严重程度，并提供潜在的治疗靶标[4]。细胞疗法已经成为现代研究的重点领域。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)又称为多能间充质基质细胞，来源于胚胎发育早期的中胚层，MSCs可以进行体外扩增和自我更新，有损伤组织的趋化性及低免疫原性的特点，并且具有免疫调节功能，在临床试验中获得广泛关注。Meng[5]等主导的间充质干细胞治疗新冠肺炎临床试验初步证明，脐带血来源的MSCs(Umbilical Cord- Mesenchymal Stem Cells, UC-MSCs)用于治疗新冠肺炎患者安全且耐受。多项临床研究表明，通过间充质干细胞治疗可改善新冠肺炎患者的呼吸功能和预后，为临床治疗提供了一个可行的方向[6]。基于目前研究状况，现将进一步探讨MSCs用于治疗COVID-19的潜在作用机制以及评估其在临床试验中的可行性，以期提供MSCs潜在治疗价值的参考信息。

间充质干细胞的免疫调节及抑制炎症细胞因子风暴作用机制

MSCs在免疫调节和抗炎信号转导方面的特性特别适合用于重症COVID-19治疗，主要是通过免疫细胞激活免疫应答，并参与非特异性免疫调节和特异性免疫调节。由于危重症患者的免疫过度激活与免疫抑制转化迅速，间充质干细胞能够通过直接接触或旁分泌多种细胞因子调节免疫细胞[7-8]，适时抑制过激免疫反应，保护肺泡功能，降低新冠肺炎患者肺脏和全身脏器损伤。

一、非特异性免疫应答和SARS-CoV-2感染

1 中性粒细胞与MSCs

COVID-19患者随着病情进展白细胞计数、中性粒细胞百分比、绝对中性粒细胞计数、中性粒细胞与淋巴细胞比值(Neutrophil to Lymphocyte Ratio, NLR)逐渐增加[9]。在COVID-19患者肺部标本中发现肺毛细血管及肺泡腔中存在着中性粒细胞浸润[10]。且患者支气管肺泡灌洗液中，中性粒细胞计数被证实与COVID-19的严重程度和细胞因子风暴呈正相关。NLR升高与COVID-19患者的不良临床特征和死亡相关，并被确定为重症COVID-19患者感染的独立危险因素[11]。MSCs可与中性粒细胞相互作用，通过IL-6介导抑制静止期，中性粒细胞的凋亡，通过IL-8和巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration Inhibitory Factor, MIF)募集中性粒细胞[12]。骨髓间充质干细胞衍生的外泌体被证实可以显著减少重症COVID-19急性呼吸窘迫综合征患者中性粒细胞的产生[13]，减少了免疫复合物介导的血管炎的血管破坏和出血。中性粒细胞可以在早期以趋化作用到达感染部位，通过活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的氧化爆发和吞噬作用杀死病原体。而MSCs能抑制氧化性爆炸诱导的中性粒细胞死亡和过氧化物酶/蛋白酶溢出，还可以减少中性粒细胞胞外杀菌网络(Neutrophil Extracellular Traps , NETs)的形成[14]和吞噬中性粒细胞。NETs在COVID-19疾病的免疫病理学中，起着核心作用，针对NETs的治疗可降低COVID-19的临床严重性和死亡率[10]。MSCs在保留了中性粒细胞的基本功能的同时，防止氧化代谢的过度或不适当激活，从而在炎症反应中发挥保护作用，中性粒细胞可能是重症COVID-19患者免疫病理并发症的靶标。

2 抗原呈递细胞与MSCs

树突状细胞(Dendritic Cells, DC)是主要的抗原呈递细胞，可桥接非特异性免疫应答和特异性免疫应答。Yang等[15]证实COVID-19患者肺部感染的DC可能是产生促炎细胞因子的来源，通过平衡Th1 / Th2反应和调节细胞因子的产生进而影响疾病进展。MSCs可以在PGE2的介导下抑制DC的早期成熟[16]。另外，MSCs可以通过jagged1/Notch途径[17]，或肝细胞生长因子(HGF)/ Akt途径[18]诱导成熟的DC(mDC)分化为低表达CD80和CD86的调节性DC(DCreg)，从而减轻肺部急性的病理损伤。巨噬细胞是抗原呈递的重要组成部分，可分为M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞，前者可产生各种促炎因子来对抗与组织再生相关的病原体，后者可产生IL-10发挥免疫调节作用。在COVID-19早期到晚期病例中，SARS-CoV-2感染引起的局部炎症的发生会激活该部位的巨噬细胞，迅速扩散到整个肺部。冠状病毒S蛋白，通过在体外激活NF-κB途径诱导人单核细胞/巨噬细胞的非特异性免疫应答[19]，巨噬细胞可通过炎症因子影响单核细胞，中性粒白细胞和淋巴细胞等，成为细胞因子风暴的关键细胞[20]。而MSCs可以分泌TSG-6因子和IL-10来抑制NF-κB信号传导通路和其他促炎途径，还可以调节巨噬细胞极化，使M1型巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞[21]，导致高水平的抗炎因子和低水平的促炎因子，通过增加IL-10以及减少TNF-α和IL-6的产生从而抑制炎症进展并促进已受损组织的愈合。单核细胞在非特异性免疫应答中是重要效应器和调节剂，当肺损伤时，单核细胞在短时间内优先迁移至肺部炎症部位，并促进中性粒细胞募集和放大肺损伤，最终分化为DC和巨噬细胞[22]。在重症COVID-19患者中，单核细胞可能在细胞因子风暴病理过程中发挥着重要作用。MSCs被发现可以干扰单核细胞向DC和巨噬细胞的分化，进而在吞噬作用和抗原呈递过程中起着抑制作用[23]。

3 自然杀伤细胞与MSCs

自然杀伤(Natural Killer, NK)细胞在非特异性免疫应答中发挥清除病毒和控制病毒感染的功能。COVID-19感染患者的支气管肺泡灌洗液所含NK细胞的比例为中度感染明显高于健康者，重度却低于轻中度感染，康复期高于活动期，表明NK细胞的免疫状态在一定程度上与COVID-19患者疾病的严重程度和预后相关[24]。体外高比例NK细胞与MSCs直接共培养时，MSCs不会影响NK细胞系的增殖，但会差异性调控NK细胞产生IFN-γ[25]。而NK细胞分泌IFN-γ可以激活MSCs从而发挥抗炎作用[26]。Ghanavatinejad等[27]证实月经血来源的MSCs可调节NK细胞的分化。MSCs与NK细胞相互作用复杂，主要包括三个机制：(1)细胞之间直接的细胞间接触； (2)释放外泌体，细胞因子(IFN-γ，TGF-β，IL-1等)和activin A等可溶性因子； (3)通过调节其他细胞(例如调节性T细胞)的间接作用。在将NK细胞作为治疗靶点的相关疾病中，MSCs细胞具有作为治疗工具的巨大潜力，可能会引发更具体、更理想的治疗结果，在明确的条件下进行进一步的研究是非常必要的。

4 肥大细胞与MSCs

肥大细胞是非特异性免疫应答重要的前哨细胞，同时在促进血栓形成和其他并发症方面发挥重要作用。此外，在COVID-19患者中发生的高炎症性细胞因子风暴(Hyperinflammatory cytokine storms，HCS)可能源于SARS-CoV-2释放组胺，增加IL-1水平，引起克隆性肥大细胞的功能失调引起的非典型反应[28]。Afrin等[29]初步发现COVID-19患者使用针对肥大细胞或其介体的药物是有效的，MSCs对肥大细胞募集和脱粒不起作用[30]，但分泌出的转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β, TGF-β)可调节肥大细胞中的TNF-α，进而调节免疫[31]。

二、特异性免疫应答和SARS-CoV-2感染

1 T淋巴细胞与MSCs

CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞减少也是COVID-19患者的显著特征，影响COVID-19的疾病严重程度和死亡率主要是CD8+T淋巴细胞，导致Th1/Th2不平衡[32]，而免疫系统因细胞因子风暴异常激活和失调进而出现严重的免疫失衡。MSCs可以通过TGF-β和肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)抑制G1期T细胞的增殖，也可以通过NKG2D途径抑制异常激活的Th1细胞，恢复Th1 / Th2平衡。MSCs直接或间接抑制T细胞的活化，诱导IL-10的产生并抑制IFN-γ、TNF-α和IL-17的分泌，并上调IL-4的分泌，负反馈调节多种T细胞亚型的功能来改善特异性免疫状态[33], 不同T细胞在未暴露的供体中靶向非结构性区域(ORF1的NSP-7和NSP13)以及核衣壳蛋白(NP)的多个区域，从而使体内环境从促炎状态转变为抗炎状态。

2 B淋巴细胞与MSCs

B淋巴细胞在COVID-19感染期间患者体内抗体的产生和特异性免疫调节至关重要。COVID-19患者中性粒细胞计数增加，在炎症环境下释放可溶性BAFF，而BAFF水平与B淋巴细胞计数呈正相关[34]。B淋巴细胞被激活成浆细胞后分泌的抗体可以结合SARS-CoV-2结构蛋白S蛋白和N蛋白[35]，并以高免疫原性与S蛋白S1亚基结合潜在中和并阻止病毒与ACE2受体之间的相互作用[36]。MSCs可以抑制B淋巴细胞增殖，向浆细胞的分化以及分泌抗体，还可以诱导调节性B细胞，进而产生IL-10，从而发挥抗炎作用[37]。

MSCs治疗COVID-19的可行性分析

目前有72项评估MSCs治疗新型冠状肺炎的安全性和有效性的临床试验在美国国立卫生研究院网登记注册(https://clinicaltrials.gov)，并且其中30项已处于完成状态。MSCs用于新冠肺炎患者治疗的相关研究仍处于摸索阶段，Hashemian等[38]的1期临床试验结果表明，多次、大剂量输注同种异体产前来源(脐带血与胎盘来源)的间充质干细胞是安全的，Meng等[5]的一项1期临床试验中未观察到严重的人脐带血来源的间充质干细胞UC-MSCs输注相关不良事件，表明静脉输注UC-MSCs是安全的，中、重度新冠肺炎患者耐受性良好。最近，Shi等[39]在一项对100名重症新冠肺炎患者的随机、双盲、对照的2期临床试验中发现，UC-MSCs治疗新冠肺炎所致的肺损伤是一种安全且潜在有效的治疗方法。

SARS-CoV-2通过表面的S蛋白与靶细胞的血管紧张素转换酶2受体(ACE2)作用，从而感染细胞[40]。当患者的免疫系统为杀死病毒而被过度激活时，会生成大量的炎症因子，导致严重的细胞因子风暴[3]，造成严重的器官损伤甚至死亡。避免细胞因子风暴可能是治疗CoV-19感染患者的关键之一。

MSCs在抗炎、再生、免疫调节等方面有着巨大潜力，能通过直接接触或旁分泌多种细胞因子调节免疫细胞[7]，包括中性粒细胞[12]、树突状细胞[15, 17]、巨噬细胞[21]、单核细胞[41]、自然杀伤细胞[25, 26]、肥大细胞[28, 31]等非特异性免疫应答途径和T淋巴细胞[42]、B淋巴细胞等特异性免疫应答途径。值得一提的是，Leng等[6]的研究发现，MSCs的ACE-2受体和TMPRSS2表达均为阴性，表明MSCs对SARS-CoV-2有着天然的免疫力，这一点提示MSCs治疗新冠肺炎有着广阔前景。

MSCs能够通过直接接触或旁分泌多种细胞因子调节免疫细胞，抑制细胞因子风暴，保护肺泡功能，降低新冠肺炎患者肺脏和全身脏器损伤，改善重症新冠肺炎患者的身体情况[5, 38]。MSCs还可以通过旁分泌、细胞外囊泡的转移或细胞与细胞的接触，促进上皮和内皮细胞的恢复，促进微生物和肺泡液的清除[43]。

综上所述，间充质干细胞的治疗可以考虑作为控制新冠肺炎细胞因子风暴的策略之一。需要注意的是，这些临床试验存在一些局限性。首先，多数试验样本数量较小，可能存在误差，结论可靠性存疑。其次，部分临床试验迫于情况紧急、捐献来源减少等情况，起用冷冻库存的间充质干细胞，其活力同新鲜来源的间充质干细胞可能存在差异。最后，还需要进行相关的3期试验，以进一步评估MSCs用于预防新冠肺炎患者长期肺部残疾、降低其死亡率的效果以及探究MSCs治疗COVID-19疾病的潜在机制。