杨阳 郭金双,2 郑秀娥 崔涛 王玉 陈洪忠 夏文龙＊

1 山东省食品药品审评查验中心 （山东 济南 250014）

2 山东政法学院 （山东 济南 250014）

内容提要： 类风湿因子检测试剂是用于体外定量检测人体样本中类风湿因子浓度的试剂，临床上主要用于类风湿关节炎的辅助诊断。文章重点对类风湿因子检测试剂注册技术审评要点进行探讨和详细解析，旨在为注册申请人提供建议和参考。

自身抗体是人体针对自身组织、细胞或蛋白质等自身抗原产生的抗体。在正常情况下，人体具有完整的自身免疫耐受机制，对自身组分不产生或仅产生微弱的免疫应答，不会引发疾病。当自身免疫耐受机制遭到破坏时，人体产生的自身抗体超过某一水平，就可能导致自身组织损伤而引起自身免疫性疾病。类风湿因子是针对人变性免疫球蛋白G分子Fc片段的一种自身抗体，主要存在于类风湿关节炎患者血液中，是诊断类风湿关节炎最早使用的血清学指标。类风湿因子有五种亚型，分别是IgM、IgG、IgA、IgD和IgE，临床上对类风湿关节炎的诊断、分型和疗效观察通常以检测IgM型类风湿因子为主。

类风湿因子检测试剂是临床辅助诊断类风湿关节炎的重要工具之一，目前国内类风因子检测用相关试剂产品注册证有200余张，但由于法规更新和产品的更新迭代，该产品注册申报过程中仍存在一些问题，本文根据体外诊断试剂注册相关法规和类风湿因子检测试剂注册申报现状对注册技术审评要点进行探讨和详细解析，旨在为注册申请人提供建议和参考。

1.适用范围

目前已上市的类风湿因子检测试剂的方法学有免疫比浊法、胶体金免疫层析法、化学发光法、酶联免疫吸附法等，其中免疫比浊法占比87%，为临床上主要使用的检验方法。本文所指类风湿因子检测试剂是以免疫比浊法为基本原理，利用生化分析仪等分析仪器体外定量检测人体血清或血浆样本中类风湿因子含量的试剂。

2.分析性能评估

2.1 分析性能总体要求

类风湿因子检测试剂分析性能评估主要包括样本稳定性，空白限、检出限及定量限，准确度，精密度，分析特异性，高剂量钩状效应，测量区间，校准品量值溯源和质控品赋值等项目的研究资料。申请人需用多批产品进行分析性能研究，如申报产品适用于多个适用机型应在各个机型上分别进行研究，如申报产品有不同的包装规格应对各包装规格进行分析或验证。用于分析性能评估的产品应该是在原材料和生产工艺经过选择和确认、质量管理体系有效控制并且保证产品质量稳定的基础上生产的[1]。分析性能评估时应包含所选用的校准品、质控品以评估整个系统的性能。

2.2 空白限、检出限、定量限

空白限、检出限、定量限是针对类风湿因子检测试剂对样本浓度下限检出能力的评价指标。空白限是指空白样本的检测上限，一般通过检测空白样本来确定。检出限是可持续检出待测物的最低浓度，可通过对已知浓度的样本进行系列稀释后重复检测获得。定量限是指达到预设准确度要求时可测量的最低待测物浓度，需考虑正确度和精密度的要求。

2.3 线性

线性是体外诊断试剂产品准确性评价的基础，也是整个IVD产品质量评价的关键[2]。评价线性通常采用高浓度样本与低浓度样本混合稀释所得到的线性参考品，线性参考品浓度应能覆盖试剂宣称的线性范围，浓度点应不少于5个，每个浓度检测3次，求平均值。以理论浓度为自变量，以检测浓度平均值为因变量求出线性回归方程，计算相关系数（r）以及检测均值与理论值的相对（或绝对）偏差。一般情况下，相关系数r应≥0.990；线性区间内的偏差可以分段以相对偏差或绝对偏差表达。

2.4 正确度

正确度由系统测量误差决定，正确度的度量为偏倚[3]。申请人可根据参考物质、比较测量程序等的可获得性选择合适的方法进行正确度评价。正确度研究方法通常有相对偏差法、回收试验法、比对试验法三种。相对偏差法是用待评价试剂检测有证参考物质（CRM）或其他公认的参考物质、或由参考方法定值的不同浓度的人源样品，计算相对偏差。回收试验法即加标回收，是通过在人体样本中加入一定体积标准溶液或纯品，用待评价试剂分别检测加标样本和基础样本，计算回收率。比对试验法由申请人选取已上市的检测系统作为比对方法，用待评价试剂和比对试剂分别检测不少于40个在检测浓度范围内不同浓度的样本，计算两组检测结果的相关系数及每个浓度点的相对偏差。

2.5 精密度

由操作者、测量仪器、试剂批次、环境条件等因素引起的随机测量误差决定了产品的精密度，精密度通常包含中间精密度、重复性、再现性，可用标准差、方差或变异系数表示。重复性通常是在短时间内由同一操作者在同一测量系统、相同操作条件下对相同被测量进行重复测量的精密度。重复性应至少研究两个不同浓度水平样本重复测试的变异系数，这两个浓度水平样本应能够代表正常人群和异常人群。再现性是在不同地点、不同操作者、不同测量系统的测量条件下对同一或相似被测对象重复测量的精密度。中间精密度是指在操作者、测量仪器、试剂批次、环境条件等条件中一个或几个不同的情况下产生的精密度，它是介于重复性和再现性两种极端精密度之间的情况。

2.6 分析特异性

分析特异性包括干扰试验研究和交叉反应研究。干扰物质研究通常包括外源性干扰物质研究和内源性干扰物质研究，常见的内源性干扰物质有甘油三酯、胆红素、血红蛋白、自身抗体、异嗜性抗体等；常见的外源性干扰物质包括样本抗凝剂、常用药物及其代谢物、患者群体使用的药物及其代谢物等，申请人应根据产品特点选择潜在的干扰物质研究，并明确干扰物质不产生影响的最大浓度。交叉反应研究应对可能的交叉反应物质进行检测，并对检测结果设定合理的可接受范围，如果超出可接受范围，则认为该物质产生交叉反应，并进一步评估该物质浓度与交叉程度之间的关系。如果检测结果在接受范围内，则认为该浓度的物质不产生交叉反应，需明确不产生交叉反应的物质浓度上限。

2.7 钩状效应

钩状效应是由于抗原抗体比例不合适而导致的假阴性现象。研究发现，在一定浓度的抗体溶液中加入不同浓度的抗原时，免疫复合物的生成量先是随着抗原浓度的增加而逐步增加，在达到峰值后生成量随着抗原浓度的进一步增加反而减少，从而导致检测浓度值低于真实值[4]。在进行类风湿因子检测试剂钩状效应研究时可选择浓度比较高的样本梯度稀释，由低到高进行检测以确定不会产生钩状效应的最高浓度点。

2.8 校准品及质控品

试剂中如果包含校准品、质控品，则应参照GB/T 21415-2008、YY/T 1652-2019等相关标准的要求，提供校准品的量值溯源资料、质控品的赋值资料。校准品溯源资料中应包括溯源链、赋值程序、不确定度的研究及其评定要求。质控品赋值研究除考虑不同的适用机型外，还应考虑时间、地点、试剂批次和操作人员。校准品/质控品基质与临床样本不同时，还应进行基质效应评估。

3.参考区间

试剂参考区间研究方案应考虑年龄、性别、地域等因素，样本例数必须符合统计学要求。参考区间研究资料中除包含研究方案、样本来源、统计方法外，还应包括参考区间确定人群的纳入标准和排除标准。申请人可以通过参考文献资料的方式确定参考区间，但应采用拟申报产品对该区间进行验证，验证用样本量也应符合统计学要求，最后应在试剂说明书中注明参考区间的研究结果。临床上，在类风湿关节炎患者中类风湿因子阳性的概率大约在70%～80%，少数正常人也会出现类风湿因子阳性，此外，一些其他自身免疫病、肝炎、高球蛋白血症以及肺结核等疾病患者类风湿因子也可能为阳性[5]。由于类风湿因子针对类风湿关节炎的非特异性，所以在类风湿因子检测为阳性时还需结合其他检查及临床表现才能做出诊断。反之，如果类风湿因子检测为阴性也不能排除患类风湿关节炎的可能，需结合临床进一步检查。

4.稳定性研究

稳定性研究是对产品使用、运输以及长期储存过程中产品性能是否稳定的研究。开展稳定性研究，申请人首先应制定合理的研究方案，研究方案应包括储存条件、试剂信息、检验时间点的间隔、可接受标准等。开展长期稳定性研究，应使用三批以上的产品在规定条件下储存至成品有效期后，最后对效期后产品的性能进行检验是否符合可接受标准。使用稳定性是申报产品实际使用期间的稳定性。除开封稳定性外，还应根据实际情况开展复溶稳定性、机载稳定性及冻融次数研究。如试剂盒包括校准品，还应进行校准或校准频率稳定性研究。运输稳定性研究研究过程中，应考虑产品运输所需的正确环境条件、产品的包装方式以及暴露的最差运输条件。

5.临床评价研究

类风湿因子检测试剂已经列入免临床目录中，根据《体外诊断试剂注册与备案管理办法》，该产品可选择免于进行临床试验的临床评价路径，也可以选择开展临床试验的路径。免临床试验的临床评价研究应符合《免于临床试验的体外诊断试剂临床评价技术指导原则》的要求，临床试验的开展应符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》《医疗器械临床试验管理规范》的要求。

5.1 受试人群及样本要求

临床评价受试人群应能代表产品预期用途所声称的适用人群的特征。所选取的样本应能评价产品临床应用过程的安全性、有效性，并能涵盖预期用途和干扰因素。样本量的计算应根据产品特点、统计学分析模型等要素选择合适的样本量估算方法。

5.2 统计学分析

体外诊断试剂临床评价的统计分析包括参数估计和假设检验。参数估计用于确认灵敏度、特异性、回归系数和截距等评价指标的水平，假设检验是通过对统计学指标提出无效假设或备择假设，进行相关统计学推断。类风湿因子检测试剂为定量检测试剂，统计分析过程中，应先根据临床试验数据的正/偏态分布情况，选择合理的统计学方法进行分析，如：根据临床试验数据绘制散点图，进行相关分析；采用Bland-Altman法，评价待评价试剂与比对试剂两种检测结果的一致性；通过回归分析对两种检测系统的一致性进行评价，回归分析时应重点观察回归系数、回归拟合方程（斜率和y轴截距）等，并计算回归系数和截距的置信区间。最后需对所评价指标进行假设检验。

6.产品技术要求及检验报告

产品技术要求是对产品使用性能、理化性能、安全性能等方面提出的要求，体外诊断试剂产品技术要求主要包括性能指标及检验方法。

6.1 主要性能指标

性能指标主要是针对成品可客观判定的功能性和安全性指标。定量检测试剂主要包含物理指标（如：外观、装量），分析灵敏度指标（如：空白限、检出限），准确度指标（如：正确度、精密度），以及线性、稳定性等其他指标。如果试剂盒中包括校准品、质控品，还应针对性的制定相应的指标，如校准品的物理性状、正确度、水分含量、均匀性等，质控品的物理性状、可接受范围、均匀性等。产品技术要求的制定可以参考YY/T 1255-2015、YY/T 1549-2017、YY/T 1662-2019、YY/T 1652-2019等行业标准的要求，建议产品技术要求不低于行业标准的要求。

6.2 检验方法

检验方法是用来验证产品是否符合性能指标的具体操作方法。检验方法的建立应优先选择已建立的标准方法。检验方法应具备可重现性、可操作性，因此必须明确试验的具体步骤、试验的次数、最终计算方法和结果表述等，此外还应明确检验中所采用的参考品/标准品、样本等制备方法。

6.3 产品检验报告

申请人用于检验的产品应该是在原材料以及生产工艺稳定的基础上，在符合质量管理体系要求的条件下生产的产品。申请注册提交的检验报告可以是申请人的自检报告，也可以是委托有资质的医疗器械检验机构出具的检验报告[6]。如果申请人注册申请时提交自检报告，应按照《医疗器械自检管理规定》提交资料，在注册质量管理体系核查时对企业的自检能力进行检查。

7.产品说明书

说明书是指导医学实验室人员正确操作、临床医生作出合理结果解释的重要指南，是注册申报中最重要的资料之一。说明书包含了产品预期用途、检验方法、样本要求、检测结果的解释等重要信息，上述内容均应在研发过程中进行了相应的研究论证。

7.1 产品名称及预期用途

产品名称通常为类风湿因子检测试剂（免疫比浊法）。预期用途通常为用于体外定量测定人体样本中类风湿因子的浓度，样本类型可以为血清、血浆或全血，应结合产品研究实际进行描述。预期用途中还应包含临床适应症、背景情况以及常用检验方法。

7.2 检验原理及检验方法

本文所指类风湿因子检测试剂的检验原理是基于抗原-抗体反应，通过检测类风湿因子抗原抗体复合物所引起的浊度变化进行定量测定类风湿因子的浓度。说明书中检验方法是指导临床检验人员的操作方法，需详细说明试验条件（温度、时间、仪器波长等）、操作步骤（试剂配制方法、试验具体操作步骤）、结果计算方式以及试验注意事项等。此外，还应注明校准程序和质控程序，包括：校准品/质控品的使用方法、校准曲线的绘制、校准/质控周期、对质控结果的必要解释等。

7.3 参考区间及检验结果的解释

参考区间为指导临床医生作出临床诊断的重要依据。说明书除需注明本试剂盒参考区间以外，还应简要说明参考区间确定所采用的样本来源及确定方法，以供临床医生参考。同时，由于用于参考区间研究人群和研究样本量的局限性，应建议各实验室建立自己的参考区间。由于类风湿因子并不是类风湿关节炎诊断的特异性指标，检验结果的解释中应提示该检验结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。同时应说明可能对试验结果产生影响的因素，说明该检验方法的局限性。

8.小结

本文根据现行法规和类风湿因子检测试剂注册申报情况，总结分析了类风湿因子检测试剂注册申报过程中的技术审评要点，对适用范围、分析性能评估、参考区间研究、稳定性研究、临床评价研究、产品技术要求及检验报告、产品说明书等内容进行重点解析，为注册申报类风湿因子检测试剂的相关企业在申报资料的准备、撰写等实际操作层面提供工具和指南。