马红娟，白佳利，王慧，王丽红*

(1.长治市妇幼保健院，山西 长治 046000；2.长治医学院，山西 长治 046000)

儿童难治性支原体肺炎(RMPP)是儿科常见疾病，但其治疗和诊断都具有一定难度，对儿童健康造成巨大危害。RMPP患儿病情进展迅速，不仅可以引起严重的肺内外并发症，而且病情迁延不愈。对于RMPP的诊断，首先是在确诊肺炎支原体肺炎(MPP)的前提下，经过大环内酯类抗生素规律治疗后患儿病情继续加重及血清学相关检查指标明显异常的可考虑该病[1]。然而由于血清学相关检查的滞后性及缺乏特异性，不能对RMPP进行早期诊断，易延误诊治，耽误病情，给治疗增加难度。RMPP的形成主要与患儿产生强烈的免疫应答及细胞因子反应有关[2]，相关生物标志物水平也随之发生变化。因此，诊断RMPP、监测RMPP进展、判断RMPP预后的生物标志物受到广泛关注。RMPP中有许多异常表达的生物标志物，在血清、痰液中检测不敏感，缺乏特异性，标本易被污染。近年来，支气管镜已成为儿科呼吸疾病诊治中安全、有效、不可缺少的手段，而通过支气管镜肺泡灌洗不仅可以避免标本污染，而且取样范围广，被认为是目前肺炎病原学诊断更为敏感和可靠的方法[3]。因此采用肺泡灌洗生物标志物作为诊断指标能够显著提高敏感性和特异性，对疾病的早期诊断提供可能。

1 RMPP临床表现和体征及影像学检查的局限性

有关流行病学资料显示：近年来，世界各地关于RMPP的报道增多，RMPP在各个年龄段儿童中均可发生，且发病年龄有减小趋势[4-5]，所致的儿童病死率呈升高趋势[6]。研究表明[7]，RMPP较普通MPP病情进展更快，有更严重的症状及体征，多伴有胸腔积液、肺不张、实变、胸膜增厚等表现。此外，还可引起各种肺外并发症，累及多脏器，对儿童健康造成严重影响。但研究发现[8]，RMPP和MPP在咳嗽、呼吸困难等症状、体征上均无明显差别，甚至RMPP患儿听诊喘鸣音比例低于MPP患儿，这提示仅依靠一般的临床表现，无法实现对RMPP的早期诊断。另外，X线胸片也可无特征性表现，部分患儿早期还可以呼吸道外其他系统损伤的表现为首发症状，致早期误诊为其他疾病而延误治疗的最佳时机，使病情复杂化，严重者可危及患儿生命，因此，对RMPP进行早期诊断有重要意义[9]。

2 传统诊断方法的局限性

RMPP是目前全球面临的一个重要卫生问题，临床上各项实验室检查对其早期诊断有重要意义，其中肺炎支原体(MP)分离培养和血清学检测由于其滞后性对RMPP的早期诊断意义不大，聚合酶链反应(PCR)特异性和敏感性强，不仅可以用于早期诊断，还可评估疗效，但其对实验室的条件要求较高，一般医院实验室难以满足，尚未在临床诊断中普遍应用[10]。RMPP主要是与机体免疫紊乱有关，研究其肺泡灌洗生物标志物已成为儿科领域的热点。近年来，支气管镜已成为儿科呼吸疾病诊治中安全、有效和不可缺少的手段，在病变部位进行支气管肺泡灌洗，与血液、咽拭子等其他方式进行对比更直接、准确，MP阳性检出率也高[11]。RMPP的支气管肺泡灌洗液(BALF)中各种生物标志物的表达有一定特点，观察肺泡灌洗生物标志物变化有利于从不同生物学水平发现和预测RMPP。

3 肺泡灌洗生物标志物

随着纤维支气管镜肺泡灌洗术在儿童难治性支原体肺炎中的广泛应用，肺泡灌洗生物标志物成为研究热点。与儿童RMPP诊断相关的生物标志物有白介素-4(IL-4)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(CARDS Tx)的联合高表达、白介素-17A(IL-17A)、半乳凝素-3(Gal-3)、可溶性B7-H3(sB7-H3)等。

3.1 IL-4和IFN-γ及IL-6

目前认为RMPP的发病机制主要与免疫紊乱有关，其中T细胞介导的免疫反应起到很重要的作用，主要表现为辅助型T细胞1(Thl)/辅助T细胞2(Th2)细胞因子表达的失衡。IFN-γ主要由Th1细胞产生，调节感染后人体的细胞免疫；IL-4主要由Th2细胞分泌，调节感染后人体的体液免疫反应。因此IFN-γ/IL-4代表机体Th1/Th2免疫功能平衡，此平衡的破坏与多种疾病的发生、发展密切相关。IL-6是一种主要由单核/巨噬细胞和T淋巴细胞产生的促炎因子。据报道[12]，IL-6水平的增高是感染出现的最早炎性指标，且有研究证实[13]，IL-6也参与了细胞和体液免疫反应的过程，间接引起IFN-γ/IL-4水平的改变。

谭力等[14]通过分析47 例RMPP患儿和28 例支气管异物患儿的BALF发现，RMPP患儿BALF中IL-4和IL-6及IFN-γ水平明显升高，提示RMPP患儿病变局部炎症反应明显。相关研究发现[15]，RMPP急性期组BALF和血清中IFN-γ和IL-4及IL-6水平均明显高于对照组和恢复期组，提示RMPP感染的急性期均可介导BALF和血清中细胞因子IFN-γ和IL-4及IL-6水平明显升高，且通过受试者工作特征(ROC)曲线分析证实BALF中各指标对RMPP的诊断准确性均高于血清，尤其是IFN-γ/IL-4表现出对于RMPP的高度诊断价值。俞慧君等[16]通过回顾性分析难治性肺炎支原体肺炎和肺炎支原体肺炎的住院患儿各30 例的BALF，发现其中IFN-γ和IL-4水平均增高，且IFN-γ/IL-4越低越有助于早期识别RMPP。同时，BALF中IL-6水平对RMPP的诊断也有重要意义，且经过治疗后IL-6水平可下降，提示RMPP患儿BALF中IL-6水平与病情进展及严重程度相关，可为临床早期诊断提供新思路。

3.2 TNF-α和社区获得性呼吸窘迫综合征毒素的联合高表达

肿瘤坏死因子可分为TNF-α和TNF-β两种，前者来自单核巨噬细胞，后者由活化T细胞产生，是具有重要生物活性的细胞因子。TNF-α是一种促炎因子，是各种免疫介导疾病的治疗靶点之一。TNF-α可诱导中性粒细胞的趋化作用和局部浸润、吞噬和杀伤病原体，从而启动炎症反应。适量的TNF-α对机体有保护作用，过量则引起免疫反应过度，引起局部甚至全身炎症反应，严重者可致多系统损害。任勇等[17]研究发现，MPP患儿的TNF-α水平较健康儿童明显增高，为早期诊断MPP提供可能。因此，探讨RMPP患儿BALF中TNF-α的表达具有重要意义。社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(CARDS Tx)由MP产生，是一种具有ADP核糖基转移酶和空泡化活性的毒力因子。既往认为MP无法分泌毒素，2005年Kannan等[18]通过研究MP与人表面活性蛋白的作用机制发现，MP可分泌MPN372毒力因子，2006年该毒素正式被命名为CARDS Tx。CARDS Tx本身还可诱导强烈的炎症反应，Bose等[19]研究发现，CARDS Tx可通过与NOD样受体蛋白3(NLRP 3)炎症体共定位和催化NLRP 3的腺苷二磷酸-核糖基化(ARL)而激活NLRP 3炎症小体。NLRP 3炎症体是一种经过广泛研究的炎症复合体，可通过各种途径引起机体严重炎症反应。LI等[20]通过分析21 例RMPP患儿和50 例普通MPP患儿BALF的TNF-α和CARDS Tx毒素水平，发现RMPP患儿的TNF-α和CARDS Tx水平较对照组明显升高，且71 例MPP患儿BALF中CARDS Tx毒素与TNF-α的表达呈正相关，提示高水平的CARDS Tx毒素可诱导TNF-α的表达，表明CARDS Tx毒素与TNF-α之间的潜在联系及其在MPP中的致病作用。该研究为RMPP的早期诊断提供了新的证据，TNF-α的高表达可能是预测RMPP的一个很好的指标。

3.3 IL-17A

IL-17是一种可以诱导中性粒细胞分化和转移的促炎因子，主要由Th17细胞产生。IL-17对于防止微生物入侵、感染蔓延有重要作用，主要表现为在吞噬细胞的形成中起重要作用和诱导各种免疫蛋白的产生[21]。有研究报道[22]，IL-17A通过诱导各种促炎因子和趋化因子，增强抗体产生，激活T细胞在早期免疫应答反应中起主要作用。研究发现[23]，与普通MPP儿童相比，RMPP患儿BALF中IL-17A的表达明显降低，同时发现RMPP患儿中IL-17A的转录因子——孤核受体(ROR γτ)较普通MPP患儿和健康儿童都低，且通过比较RMPP患儿和普通患儿ROC曲线发现BALF中IL-17A高表达的可能性较低。因此，推测BALF中IL-17A的降低可能是诊断RMPP患儿的一个有价值的生物标志物，有助于RMPP的早期诊断。IL-17A在RMPP中的发病机制有待进一步研究，对RMPP的诊断和治疗均有重要意义。

3.4 Gal-3

Gal-3是凝集素超级家族中的一个家族，广泛分布于各种动物体内，对β-半乳糖苷有特殊的亲和力，在细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤转移等许多生理和病理过程中发挥重要作用。其中研究最多的是Gal-3，这是一种广泛存在的具有多种生物学功能的蛋白质，在自身免疫和免疫介导的炎症疾病中发挥重要作用[24]。Gal-3是由肺部Clara细胞及巨噬细胞产生，它参与了中性粒细胞的激活和黏附、巨噬细胞的化学趋化等[25]。MP损害患儿下呼吸道，主要依赖巨噬细胞的吞噬作用清除，Gal-3通过刺激巨噬细胞活化而清除MP[26]。田芳等[27]研究发现，MPP患儿急性期血清中Gal-3水平升高，升高水平与病情的严重程度相关，表明Gal-3参与了MPP的炎症反应，并反映病情严重程度，可作为病情评估的指标。赵茜叶等[28]研究也发现，RMPP患儿BALF中Gal-3水平急性期和恢复期均比对照组显著增高，恢复期较急性期下降，但恢复至正常水平可能会需要至RMPP恢复期后一段时间。该研究还发现，RMPP患儿BALF中Gal-3水平与MP载量、中性粒细胞百分比呈明显正相关，因此表明Gal-3参与RMPP气道炎症反应过程，并且与中性粒细胞趋化作用及浸润密切相关。李俊利等[29]通过对比103 例RMPP患儿和30 例支气管异物患儿的BALF发现，RMPP患儿的Gal-3、肺炎支原体载量、中性粒细胞及巨噬细胞水平显著增高，RMPP急性期患儿的Gal-3、肺炎支原体载量、中性粒细胞水平与恢复期相比有显著差异，故推测Gal-3在RMPP气道炎症中具有重要价值，其水平与肺炎支原体载量及中性粒细胞水平密切相关。因此推断，患儿BALF中Gal-3水平检测可作为RMPP早期诊断的指标之一。

3.5 可溶性B7-H3

B7-H3是新发现的共刺激分子B7家族的成员，是T细胞的辅助性刺激因子，目前B7-H3调控Th细胞分化仍存在争议，B7-H3对T细胞有共刺激和共抑制两方面的调节作用，既可促进IFN-γ，TNF-α和IL-6的分泌，也可抑制其分泌。B7-H3存在膜型B7-H3(mB7-H3)和sB7-H3两种表达形式，单核细胞、树突状细胞、活化的T淋巴细胞上的mB7-H3在金属蛋白酶剪切作用下可以脱落形成sB7-H3，能与活化的T细胞的B7-H3受体结合，参与外周免疫调节。

张新星等[30]研究发现，RMPP患儿急性期BALF中sB7-H3与IL-1β，IL-2，IL-36的表达都呈高水平，且sB7-H3水平与上述炎症因子水平呈正相关，经抗MP感染及感染后炎症反应治疗，BALF中sB7-H3，IL-1β，IL-2和IL-36的表达水平明显降低。以此推测sB7-H3通过调控上述炎症因子，参与MP感染后免疫反应及肺损伤，从而导致RMPP的发生及发展。梁利红[31]研究发现，RMPP病患儿肺泡灌洗液sB7-H3较MPP患儿明显升高，与上述结果一致。因此，sB7-H3可作为RMPP早期诊断的一个生物标志物。

4 结论及展望

RMPP诊断依赖多种因素，主要依临床表现和血清学检查进行判断，但因其不典型性及滞后性，近年来肺泡灌洗生物标志物的研究成为热点。虽然目前还不清楚这些生物标志物在RMPP中如何起作用，但识别这些生物标志物有助于更好地了解RMPP的炎症进展情况及产生机制，从而为早期诊断RMPP提供思路。RMPP的早期诊断有助于早期干预治疗，不仅可改善病情、缩短病程，而且是预防并发症或后遗症的关键。

随着肺泡灌洗术的广泛应用及研究，涉及RMPP的生物标志物越来越多，新的生物标志物逐渐被发现并用于RMPP的诊断，其中研究较多的有IL-4，IFN-γ，IL-6，TNF-α与CARDS Tx的联合高表达及IL-17A，Gal-3，sB7-H3。RMPP患儿BALF中IFN-γ，IL-4，IL-6，TNF-α，CARDS Tx，Gal-3和sB7-H3水平病程初期均明显增高，且其增高程度可能与疾病严重程度相关。RMPP患儿BALF中IL-17A水平、IFN-γ/IL-4较普通MPP患儿降低，且IFN-γ/IL-4越低越有助于早期识别RMPP。其中对早期识别RMPP最有效、临床上应用较多的生物标志物可能是IFN-γ，IL-4和IL-6，为预防和治疗RMPP提供新的思路。但这些生物标志物在临床上应用的广泛性和准确性仍有待提高，期望发现更多的肺泡灌洗生物标志物，从而在RMPP的早期诊断上取得突破。