胡变芳，王怡骅，郝辉芳*，杨博雯，吉莉

（1.晋中学院 生物科学与技术系，山西 晋中，030619；2.太原科技大学 环境与安全学院，山西 太原，030024）

0 引言

小环藻（Cyclotella）隶属于硅藻门、中心硅藻纲、盘状硅藻目、圆筛藻科、小环藻属，是一种典型的微藻，藻体圆盘状或短柱状［1］。小环藻体小，生长繁殖快，适合生长在光照充足，温度变化波动较小的淡水、半咸水及海水中，通常是季节性的优势种。小环藻营养丰富，体内含有大量多不饱和脂肪酸和无机盐，可以作为水产养殖的首选饵料［2］。小环藻还可以作为环境指示种反应养殖环境水质情况，维持水体生态平衡，调节水产养殖的水生态［1］。

小环藻光合色素含量丰富，具有极高的光能利用率和营养吸收率，其中叶绿素是其进行光合作用的主要色素［2-3］，少量的岩藻黄素也作为光合色素参与光合作用。岩藻黄素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、减肥、神经细胞保护等多种功能，作为药物、保健品及美容护肤产品添加物得以广泛应用［4］。其次，小环藻具有抗氧化、降血压、抗血栓、抗肿瘤等功能，在医疗保健领域具有广阔的应用前景［5-6］。国内外有许多关于小环藻培养条件和生长状况的研究，主要集中于光照、温度、微量元素等培养条件［7-8］。研究发现，改变小环藻的温度，光照、盐度以及pH等培养条件，有助于提高小环藻的生物量和相关代谢产物如油脂的积累，但在较高的温度和光照强度培养下又会抑制其生长［9-10］。王洁玉等［10］研究发现Fe、Co、Mo 3种微量元素对小环藻细胞密度和平均生长速率的影响顺序为：Fe＞Mo＞Co，对小环藻的最大叶绿素a含量的影响顺序为：Fe＞Co＞Mo。马剑敏等［11］发现在培养中期较高的铁浓度对小环藻的细胞密度和叶绿素a质量浓度均有明显的促进作用；在培养20 d后，当培养液中的铁浓度低至0.15 mg/L～0.16 mg/L时小环藻细胞增殖缓慢。许珍等［12］发现在培养的14 d内，小环藻在15℃～30℃时藻细胞对自身生理的调节能力较强，为适宜的生长温区。但目前很少有关于植物激素对微藻生长状况的研究。

油菜素内酯（brassinoslide，BR）是一种生理活性很强的天然植物激素，微量即可对植物的生长起到较大的促进作用，在国际上被誉为“第六大植物激素”［13-14］。有研究发现BR可以调节植物的生长速率，且与其他激素共同使用可以相互影响发挥同种生理效应。BR的主要生理功能是促进细胞伸长和分裂，对植物体内有机物含量进行调节，影响核酸类物质的代谢，增强植物自身的生长优势，从而达到提高作物产量的效果，且对人体无副作用，还可避免农药对环境的污染。2，4-表油菜素内酯（Epibrassinolide，EBR）是人工合成的油菜素内酯类似物，对植物的生长和发育具有重要作用，现已广泛应用于不同植物中［15-19］，如促进农作物生长、提高座果率、提高植物抗逆性等，但对单细胞藻类的生长和生理特性影响研究较少。天然水体中小环藻与其他藻类混杂生长，种群密度低，人工培养的又生长速度缓慢，不利于小环藻的大规模培养。因此，探究EBR对小环藻培养的影响，有助于实现微藻的高密度人工培养，提升藻类生物量积累。

本研究采用小环藻为材料，以5种不同浓度的EBR对其进行处理，在光照培养箱中连续培养，通过测量小环藻叶绿素a、叶绿素b、岩藻黄素、蛋白质几项生理指标的变化，对其生长状况和生理特性进行研究，拟找出促进小环藻生长和有机物质积累的最适浓度，为小环藻大规模培养和功能开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

FACHB-1658小环藻（购买自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库）、2，4-表油菜素内酯（EBR）（色谱纯）、岩藻黄素（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、标准牛血清蛋白溶液（分析纯）、考马斯蓝G-250（分析纯）等。

1.2 试验仪器及设备

FR1004电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）、MH-250可调式电热套（北京科委永兴仪器有限公司）、EV-2000紫外可见分光光度计（上海昂拉仪器有限公司）、SW-CJ-1 FD单人单面净化工作台（江苏通净净化设备有限公司）、MLS-3780高压蒸汽灭菌器（日本三洋电器有限公司）、SPX-300BG光照培养箱（上海博讯实业有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 小环藻的培养及处理

无菌条件下将藻液与配制好的CSI培养基以1∶4～1∶5的比例分装于锥形瓶。分别取0、35、70、105、140 μL 的 EBR（1 mg/mL），加到培养瓶中使EBR浓度分别为0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L。摇匀置于光照培养箱中培养，培养条件：温度25℃，光照强度6000 Lux，光暗周期12 h∶12 h。每个浓度梯度设置3个平行。培养10 d后，每隔2 d取适量藻液测定相关指标，连续测定5次。

1.3.2 小环藻生长曲线测定

分别测定添加不同浓度EBR后小环藻的生长曲线。从5个不同浓度EBR的培养液中分别取3 mL小环藻藻液，用分光光度计测定波长680 nm下藻液的OD值，根据测定结果绘制天数-光密度曲线图（图1）［14］。

图1 不同浓度EBR处理下的小环藻藻密度Fig.1 Density of cyclotella under different concentrations of EBR

1.3.3 叶绿素含量的测定

量取小环藻藻液10 mL，加无水乙醇5 mL，充分摇匀，静置10 min。以10 mL空白培养基与5 mL无水乙醇混合液作为空白对照。取3 mL静置后的上清液，分别测定其在663 nm和645 nm处的OD值［20］。重复3次后取平均值。按表达式（1）和表达式（2）分别计算出叶绿素a、b的浓度。

根据计算结果分别绘制不同浓度EBR处理后小环藻中叶绿素含量的柱形图2和图3。

图2 不同浓度EBR处理下的小环藻叶绿素a含量Fig.2 Chlorophyll a content of cyclotella under different concentrations of EBR

图3 不同浓度EBR处理下的小环藻叶绿素b含量Fig.3 Chlorophyll b content of cyclotella under different concentrations of EBR

1.3.4 岩藻黄素含量的测定

配制浓度分别为0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00 mg/L 岩藻黄素，编号1—11。分别取3 mL不同浓度的岩藻黄素于同种规格比色皿，测定波长为450 nm时的OD值。根据测定结果，绘制标准曲线，得出线性方程［21］。量取10 mL小环藻藻液于试管中，加入5 mL无水乙醇，摇匀后静置10 min。吸取3 mL上清液转入同种规格的比色皿中，以等比例空白培养基无水乙醇混合液为空白对照，测定在波长450 nm处的OD值，重复3次后取平均值。对照岩藻黄素标准曲线计算出岩藻黄素含量。绘制不同浓度EBR处理后小环藻中岩藻黄素含量的柱形图（图4）。

图4 不同浓度EBR处理下的小环藻岩藻黄素含量Fig.4 Fucoxanthin content of cyclotella under different concentrations of EBR

1.3.5 蛋白质含量的测定

配制浓度分别为0、10、20、30、40、50 mg/L的标准牛血清蛋白溶液2 mL，编号0—5，依次加入考马斯亮蓝染料试剂2 mL，测定波长620 nm时的OD值，等比例的蒸馏水和考马斯亮蓝染料试剂混合液作为空白对照。根据测定结果，绘制标准曲线，得出线性方程［22］。量取小环藻藻液2 mL用上述同样方法，测定样品溶液的620 nm处OD值，重复3次后取平均值。对照蛋白质标准曲线计算出蛋白质含量。绘制不同浓度EBR处理后小环藻中蛋白质含量的柱形图（图5）。

图5 不同浓度EBR处理下的小环藻蛋白质含量Fig.5 Protein content of cyclotella under different concentrations of EBR

1.4 数据处理

本试验采用浓度梯度设计，数据均由3次平行试验取平均值和标准误差得出。数据经SPSS 26.0版本软件处理，在P＜0.05水平上进行显著分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度EBR对小环藻生长曲线的影响

如图1所示，用0.00～0.20 mg/L五种不同浓度的EBR培养小环藻10 d后，10-20 d内藻密度均出现先增长后下降的趋势。对照组在12-14 d内增长较快，在第14 d时达到最高值后开始缓慢下降；而经过不同浓度EBR培养的小环藻在10-20 d内藻密度均明显高于对照组（P＜0.05），且0.20 mg/L和0.15 mg/L EBR处理下小环藻藻密度在12-20 d内较对照组差异显著（P＜0.05），以0.15 mg/L浓度最为显著，18 d时达最高值，是对照组的5.6倍，说明EBR对小环藻的生长有明显的促进作用（P＜0.05）。0.05 mg/L EBR处理下小环藻藻密度在10-20 d内较对照组差异不显著（P＞0.05），说明此浓度下小环藻生长较缓慢。

2.2 不同浓度EBR对小环藻叶绿素含量的影响

如图2所示，不同浓度EBR（0.00～0.20 mg/L）处理下的小环藻叶绿素a含量均出现先增长后下降的趋势。对照组叶绿素a含量在10-14 d内增长缓慢，14-20 d内逐渐下降，期间叶绿素a含量最高值为0.173 mg/L。而不同浓度EBR处理后叶绿素a浓度均明显高于对照组（P＜0.05），且在10-14 d明显增加。0.10 mg/L～0.20 mg/L EBR处理的小环藻叶绿素a含量在10-20 d内较对照组均差异显著（P ＜ 0.05）；在16-18 d时出现下降，0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L EBR培养的小环藻叶绿素a含量较对照组均有显著差异（P＜0.05），说明小环藻叶绿素a积累明显。且EBR浓度为0.20 mg/L处理下的第16 d出现最高值1.916 mg/L，是对照组的14.92倍。

如图3所示，不同浓度EBR（0.00～0.20 mg/L）处理下的小环藻叶绿素b含量均在10-14 d内明显增长，14-20 d内出现缓慢下降，在10-20 d培养时间内叶绿素b浓度均明显高于对照组（P＜0.05），且在10-20 d内0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L EBR处理的小环藻叶绿素b含量较对照组差异显著（P＜0.05），且在EBR浓度为0.20 mg/L处理下的第14 d叶绿素b含量出现最高值3.389 mg/L，是对照组的3.77倍。对照组10-14 d叶绿素b浓度差异不显著（P＞0.05），说明此时小环藻已经进入了稳定期，叶绿素积累缓慢。

2.3 不同浓度EBR对小环藻岩藻黄素含量的影响

如图4所示，0.05 mg/L浓度EBR处理的小环藻岩藻黄素含量随培养时间延长出现了先增长后减少的趋势，其中10-18 d较对照组相比差异不显著（P＞0.05），14-20 d内0.15 mg/L浓度EBR培养的小环藻岩藻黄素含量相比对照组差异显著（P＜0.05），表明此浓度对小环藻岩藻黄素的积累有明显的促进作用；0.20 mg/L浓度EBR处理的小环藻岩藻黄素含量随培养时间延长始终保持持续增长状态，10-20 d内均高于对照组，且与对照组相比都有显著差异（P＜0.05），在20 d时达到最高值0.294 mg/L，是对照组的12.78倍。对照组小环藻岩藻黄素含量在10-14 d内增长，14-16 d内显著下降（P＜0.05）。表明经过适宜浓度的EBR培养可延长岩藻黄素积累时间，其中0.20 mg/L浓度下积累最多。

2.4 不同浓度EBR对小环藻蛋白质含量的影响

如图5所示，不同浓度EBR（0.00～0.20 mg/L）处理下的小环藻蛋白质含量均出现先增长后下降的趋势。对照组和0.05 mg/L浓度培养的小环藻蛋白质含量基本呈现持续增长趋势，但差异不显著（P＞0.05），蛋白质含量增长缓慢。用不同浓度EBR处理的小环藻蛋白质含量均高于对照组，其中以0.15 mg/L和0.20 mg/L两个浓度处理后蛋白质增长最为明显，在16-18 d均有显著增加（P＜0.05）。在0.15 mg/L浓度EBR处理下的第18 d，蛋白质含量出现最高值0.052 mg/L，是对照组的4.33倍。

3 讨论

研究结果表明，5种不同浓度的EBR对小环藻的生长和有机物积累均有明显的促进作用，其中最适宜小环藻生长的EBR浓度为0.15 mg/L，且可以显著提高小环藻蛋白质含量的积累（P＜0.05）；0.20 mg/L的EBR处理小环藻，可促进小环藻光合色素的积累，叶绿素a、b和岩藻黄素在此浓度下积累最明显（P＜0.05）。小环藻在培养过程中需要经历适应期、对数期、稳定期、衰亡期。本研究培养的过程中，EBR对小环藻生理指标的影响包括生物量、叶绿素和可溶性蛋白质的含量都出现先增长后下降的趋势，这与小环藻的生长趋势是相似的。但岩藻黄素在培养的后期仍然保持增加状态，因为岩藻黄素属于类胡萝卜素的一种，相较叶绿素更稳定，虽然培养后期生物量不再增加，但是岩藻黄素的积累仍在增加。由试验结果可知，小环藻生长曲线和蛋白质含量的变化与叶绿素和岩藻黄素含量变化不完全一致。原因可能是，在培养的初期，叶绿素含量变化可以一定程度上代表小环藻的生长速度，两者变化趋势基本一致，但到了培养后期，细胞形状、大小都会出现变化［23］，有的甚至出现死亡，所以生长曲线与光合色素及蛋白质含量变化不完全一致。另外，小环藻的光合作用主要靠岩藻黄素吸收光能，并将其传递给少数特殊状态的叶绿素a，同时分解水进行光合作用产生糖和淀粉，再与氮、磷、硫等作用，形成蛋白质和脂质。本研究中0.15、0.2 mg·L-1处理下，叶绿素（P ＜ 0.05）在14-16 d最高，而蛋白质合成16-18 d仍然增加，跟叶绿素与蛋白质的合成过程相符合，虽然2个浓度的处理结果表面看不同，叶绿素含量和岩藻黄素含量0.2 mg·L-1处理优于 0.15 mg·L-1，蛋白质的含量0.15 mg·L-1处理优于 0.2 mg·L-1，但是统计分析这2个浓度处理没有显著性差异（P＜0.05）。叶绿素含量和岩藻黄素含量均可在一定程度上反应小环藻的生长状况，结合小环藻藻密度曲线，EBR的浓度为0.15 mg/L时，达到最大藻密度所需的时间最长，且缩短了小环藻进入对数期的时间。本研究结果与前人研究结果有所差异，如王小飞等［14］研究表明0.05 mg/L的EBR对三角褐指藻的生长促进作用最明显；凌婷等［24］研究表明，较低浓度的EBR能显著促进微拟球藻生长并提高其产油率，这可能是由于不同藻种对EBR敏感性不同。小环藻在很多领域还存在着巨大的开发潜能，较高的含油率可使其作为新型能源开发利用，对此也还有待于进一步的深入研究。本文仅研究了促进小环藻生长和有机物质积累最适宜的EBR浓度，之后可继续对EBR促进小环藻生长的具体作用机制进行深入研究，这对小环藻大规模产业化培养具有十分重要的意义。