郭旭旭 ，张国梅，郑永豪

（1.山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006；2.山西省化工研究所（有限公司），山西 晋中 030600；3.电子科技大学 光电科学与工程学院，四川 成都 611731）

0 引言

自2004年Xu等［1］研究者在纯化单壁碳纳米管过程中发现了碳量子点（CDs）以来，CDs作为一种新型［2］的荧光纳米材料引起各领域研究者极大的关注。CDs是尺寸小于10 nm的具有荧光性质的碳颗粒、为核壳复合结构、由碳核和表面的水溶性基团（-OH、-NH2和-COOH）组成，这使得CDs具有优异的水溶性和表面易于进行功能化［3］。与其他荧光纳米材料（金属纳米簇［4］、有机染料、半导体量子点等）相比，CDs具有低毒［5］、环保［6］、水溶性好［7］和生物相容性好等特性，使其在化学传感［8］、生物传感、光催化和生物成像等领域应用广泛。近年来发现了多种合成 CDs的方法，热解法［9］、水热法［10］、微波辅助合成法、激光销蚀法［11］、电弧放电法等。其中，水热法是最常用到的合成方法，通常是将含有碳源的溶液在高温高压条件下一步合成CDs，此方法具有合成过程简单［12］、成本较低、碳源来源丰富以及环境友好等优点。CDs的原料来源广泛且绿色环保，研究者将香菇［13］、西瓜皮［14］、芦荟、木瓜和红辣椒［15］等物质作为碳源合成一系列不同性能的CDs。

维生素B12是一类含钴元素的水溶性维生素，在机体内的物质代谢中起着重要作用，如：促进机体蛋白质、核酸等生物大分子的合成；提高机体对叶酸的利用率；促进红细胞的发育和成熟；促进机体神经髓鞘的形成［16］等。高等动植物是不能自己合成维生素B12（VB12），且只存在于动物类的食物中，如鱼、蛋、动物肝脏及肉类之中，奶制品中亦含少量。维生素B12缺乏或者摄入不足会出现一系列疾病，如：恶性贫血、精神忧郁［17］、幼子发育不良、脊髓变形等。此外，过量的摄入维生素B12也会产生副作用，如：哮喘、湿疹、荨麻疹、面部浮肿等过敏性症状。因此找到一种简单、响应速度快且高效的方法用于维生素B12含量的检测至关重要。近年来常用于检测维生素B12的方法有高效液相色谱法、原子吸收光谱法、比色法、化学发光、微生物法、电流分析法等。这些方法都有其自身的局限性，如：检出限比较高（μmol/L）、耗时长、需要昂贵且复杂的仪器、样品需要预处理等。因此迫切需要一种合成简单、响应速度快、抗干扰能力强、选择性高的方法用于对食品或生物样品中维生素B12的检测。

藏红花别名西红花，是一种多见的中药材，本文以藏红花为碳源，通过一步水热法合成发蓝光的荧光CDs，基于维生素B12对该CDs荧光有显著猝灭作用。因此建立了一种快速、高选择和高灵敏检测VB12的方法。如图1所示。

图1 CDs的合成及对维生素B12的响应示意图Fig.1 Schematic illustration of the synthesis of CDs and response to Vitamin B12

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

（1）试剂

藏红花购买于拉萨益昌商贸有限公司；葡萄 糖 、乳 糖 、尿 素 、Cys、VB12、Vc、VB6、VB1、Na2HPO4、NaH2PO4、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+等均购买于Sigma Aldrich化学试剂公司均为分析纯试剂；维生素B12滴眼液购买于黑龙江天龙药业有限公司；维生素B12注射液购买于上海全宇生物科技动物药业有限公司；水为高纯水（导电率＞18 MΩ）；PBS缓冲溶液由Na2HPO4和NaH2PO4配制而成。

（2）仪器

透射电子显微镜TEM（JEM-2100，JEOL有限公司），荧光分光光度计（F-4500，日立公司），红外光谱（Bruker，布鲁克科技有限公司），紫外可见分光光度计（UV-265，岛津公司），X射线电子能谱仪XPS（Kratos Axis Ulradld，Krstos公司），暗箱三用紫外线分析仪（ZE-7，嘉鹏科技有限公司）。

1.2 藏红花CDs的合成

该藏红花CDs通过参考之前文献［18］中提到的一步水热法来合成，首先将藏红花粉碎成细小的粉末，称取该粉末0.2 g溶于30 mL的高纯水中，搅拌2 min，随后将该溶液转移至50 mL的不锈钢高压反应釜中，在电热干燥箱中200℃下反应10 h，反应完后将该溶液静置、冷却至室温，过滤掉大颗粒、再通过离心机（13 000 r·min-1）将滤液离心 10 min，然后将合成的CDs放在冰箱冷藏室中储存，留得进一步表征和分析用。

1.3 CDs对VB12的检测

首先将合成的该CDs溶液稀释30倍，随后将 10 μL 的 CDs稀释液、500 μL 的高纯水和500 μL的PBS缓冲溶液（pH=5）混合形成探针溶液（probe），在上述探针溶液中分别加入不同浓度的VB12，室温下反应3 min后，在激发波长为360 nm下分别测其荧光强度。其次，在上述相同条件下，将不同浓度的葡萄糖、乳糖、尿素、Cys、Vc、VB6、VB1、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+等溶液分别加入探针溶液中，测其对CDs荧光强度的影响。

1.4 CDs对实际样品中VB12的测定

VB12注射液为粉红色澄清液体，主要用于VB12缺乏所致的贫血、生长迟缓、也可用于神经系统病变辅助治疗；VB12滴眼液是一种能够很好地用于治疗眼疲劳和干眼症的滴眼液。为了评估该CDs的实用价值，在1.3相同的条件下测其不同含量的VB12注射液和VB12滴眼液对该CDs荧光强度的影响。

2 结果与讨论

2.1 CDs的表征

图2（a）为 CDs的TEM图，可观察得：它的形状呈类球形状，有较好的分散性，且从粒径分布图计算得平均粒径为（4.1±0.3）nm。图2（b）为纯藏红花（黑线）与CDs（红线）的紫外可见吸收光谱，与纯藏红花的光谱图相比，CDs在274 nm处有明显的吸收峰出现，说明合成了CDs［19］。 插 图表明：日光灯照射下 CDs 呈棕色，紫外灯（365 nm）照射下呈现蓝光。图2（c）可知该CDs的最佳激发和发射波长分别为360和458 nm。图2（d）为纯藏红花（黑线）和CDs（红线）的红外光谱图，CDs在3377 cm-1处的较强的吸收峰归因于-OH与-NH的特征性伸缩振动、在2932 cm-1处的吸收峰为C-H的伸缩振动引起的、在1668 cm-1处较强的吸收为C=O的特征吸收峰，表明合成的CDs表面含有羧基、羟基、氨基等水溶性基团，且纯藏红花和CDs的红外光谱图较相似且存在微妙的差异，进一步说明了CDs的合成。图2（e）为CDs的XPS全谱图，表明CDs中含有C、N、O等元素。图2（f）为C 1s的高分辨率XPS光谱图，可知有C-C（284.97 eV）、C-O/C-N（286.35 eV）、C=O（288.06 eV）官能团的存在。

图2 （a）CDs的TEM图像；（b）纯藏红花和CDs的UV-vis吸收光谱图。插图：CDs在日光灯（左）和365 nm紫外灯（右）下的照片；（c）CDs的荧光光谱图；（d）纯藏红花和CDs的红外光谱图；（e）CDs的XPS谱图；（f）CDs的高分辨率C 1s谱图Fig.2 (a)TEM images of the CDs;(b)UV-vis absorption spectra of the pure Saffron and CDs.Inset:the photographs of CDs under daylight(left)and 365 nm UV light(right);(c)Fluorescence spectra of the CDs;(d)The infrared(IR)spectra of the pure Saffron and CDs;(e)XPS survey spectrum of CDs;(f)High resolution C 1s specta of CDs

2.2 CDs对VB12的荧光检测和选择性研究

通过控制变量法，研究了pH和时间对实验效果的影响。首先，将稀释后的10 μL CDs溶液、500 μL的高纯水和 500 μL的 PBS缓冲溶液形成探针溶液，加入20 μL的维生素B12溶液，记录了不同的pH对荧光猝灭效果的影响，如图3（a）可观察得pH=5时，维生素B12对探针的响应效果最佳，这与维生素B12在pH=4.5～5.0弱酸条件下最稳定、在强酸或者碱性溶液中易分解的事实相吻合。其次，将稀释后的10 μL CDs溶液和1000 μL的高纯水配成探针溶液，加入20 μL的维生素B12，记录不同的响应时间对荧光猝灭效果的影响，如图3（b）可得CDs和维生素B12最佳反应时间为3 min。

在最优条件（pH=5、响应时间为3 min、激发波长设为360 nm）下，如图3（c）可知，随着VB12浓度逐渐递增，体系的荧光强度逐渐降低，且在365 nm紫外灯照射下可观察到蓝光逐渐消失。图 3（d）可知，VB12浓度在 0～90 μmol·L-1范围内，体系在458 nm处的F0/F与VB12的浓度之间有良好的线性关系，线性回归方程为F0/F=0.048 C（μmol·L-1）+0.909，相关系数为 R2=0.995。检出限（LOD）为312 nmol·L-1。表明合成的该CDs对VB12的检测具有较高的灵敏度。

在相同的实验条件下，在探针中分别加入尿素、半胱氨酸、葡萄糖、乳糖、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+溶液 1000 μmol·L-1；VB1、VB6、Vc溶液 100 μmol·L-1时，如图 3（e）可观察到，体系荧光强度几乎都没有发生变化；随后在上述溶液中分别再加入 100 μmol·L-1的VB12溶液时，体系荧光强度都有明显的猝灭，猝灭程度（F0/F值）都在5左右。可见该CDs对VB12的检测具有良好的选择性和抗干扰性。在探针中分别加入尿素、半胱氨酸、葡萄糖、乳糖、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+溶液1000 μmol·L-1；VB1、VB6、Vc、VB12溶液 100 μmol·L-1时，图3（f）可观察到，在365 nm紫外灯照射下，只有加入VB12时，体系的蓝光消失，可以实现对VB12的定性判断。

图3 （a）pH对探针荧光强度的影响；（b）响应时间对体系荧光强度的影响；（c）不同浓度的VB12对CDs荧光强度的影响，插图：365 nm紫外灯照射下，不同浓度的VB12（0，5，20，50，80 μmol·L-1）与体系作用后的图片；（d）体系在458 nm处，F0/F和VB12浓度之间的线性关系（F0和F分别是不存在和存在VB12时体系的荧光强度）；（e）不同物质对CDs检测的选择性和干扰性；（f）365 nm紫外灯照射下，不同物质与体系作用后的图片Fig.3 (a)Effect of pH value on fluorescence intensity of probe;(b)Effect of response time on fluorescence intensity of probe;(c)Effects of different concentrations of Vitamin B12on CDs,Inset:The pictures of different concentrations of VB12(0,5,20,50,80 μmol·L-1)interacted with the system under the irradiation of 365 nm UV lamp;(d)The linear relationship between F0/F and Vitamin B12concentration at 458 nm(F0and F are the fluorescence intensity of system in the absence and presence of VB12,respectively);(e)Selectivity and interference of different substances for CDs detection;(f)The pictures of different substances interacted with the system under the irradiation of 365 nm UV lamp

2.3 CDs检测VB12机理的探讨

如图4（a），CDs的最佳激发波长为360 nm，且VB12在360 nm处有一个很强的吸收，可推知荧光猝灭机理：CDs的激发被VB12吸收所致的内滤效应。同时进行了荧光衰变实验，如图4（b）所示，通过双指数拟合，发现加入VB12时的荧光寿命从11.097 ns降低到7.821 ns，进一步说明VB12对CDs的猝灭属于动态猝灭。

图4 （a）VB12的UV-vis吸收光谱图和CDs的最佳激发光谱图；（b）体系的荧光寿命谱图Fig.4 (a)UV-vis absorption spectrum of Vitamin B12and optimal excitation spectrum of CDs;(b)Fluorescence lifetime spectra of the system

2.4 实际样品中VB12的检测

将VB12注射液（0.5 mg/mL）和VB12滴眼液（0.2 mg/mL）稀释10倍，向8个CDs溶液（2组）中分别加入10 μL的VB12注射液和VB12滴眼液，然后在上述两组溶液中分别加入不同浓度的VB12标准物质（0，10，20，40和80 μmol·L-1），并分别测定其上述溶液的荧光强度以及计算其荧光猝灭比例，根据其标准加入法求得VB12注射液和VB12滴眼液的浓度。将以上实验分别重复3次，将其结果与注射液和滴眼液的已知浓度做对比，结果如表1，可知回收率较高，表明该方法用具有一定的实用性和普适性，可用于VB12的定量检测。

表1 实际样品中VB12的检测Table 1 Determination of VB12in actual samples

3 结论

本文用一种简单的一步水热法合成了发蓝光的CDs溶液，可对VB12进行荧光检测，该方法还可以用于实际样品（VB12注射液和VB12滴眼液）中VB12的测定。此外，在紫外灯照射下，可观察到只有VB12使CDs溶液的蓝光猝灭。因此，该探针可用于实际样品中VB12的半定性和荧光定量检测。