王新超，王 璐，郝心愿，李娜娜，丁长庆，黄建燕，杨亚军

中国农业科学院 茶叶研究所/国家茶树改良中心/农业农村部 特种经济动植物生物学与遗传育种重点实验室，浙江 杭州 310008

茶树起源于我国西南地区[1]，喜温畏寒，温度是影响其分布范围、产量及经济效益的最重要环境因子之一。随着茶树种植范围的不断扩大和全球气候变化的加剧，温度对茶树生长及产量的影响加剧。无论是年生育周期还是总生育周期，茶树都会碰到多种环境逆境的胁迫，其中低温严重限制了茶树生长发育、产量、种植范围和茶叶品质。

茶树的低温胁迫分为两种：越冬期胁迫和芽萌发以后的“倒春寒”胁迫。越冬期胁迫是冬季0℃以下低温对茶树生长的影响，抗寒性差的品种其成熟叶片受到低温损伤后变得枯焦脱落，严重的会导致茶树死亡。而“倒春寒”则是指初春气温上升，茶芽萌动伸展后突然发生的急剧降温导致幼嫩新梢受冻褐变、焦枯坏死。受“倒春寒”危害的茶树茶叶品质下降，产量锐减甚至绝收，给茶农造成巨大的经济损失。因此“倒春寒”是对茶叶生产影响最大的气象灾害之一[2]。

茶树越冬期抗寒性是茶树在长期适应低温胁迫过程中逐步发展和形成的一种获得性遗传能力，需要通过一定时间的低温锻炼才能表现出来，这个过程称之为冷驯化（cold acclimation）[3]。茶树冷驯化的临界温度为7℃左右（15日平均气温），脱驯化的临界温度为9℃左右（15日平均气温）。通过冷驯化以后的茶树抗寒力提高，而脱驯化以后茶树的抗寒力又减弱[4]。而茶树的新梢在组织结构、叶片含水量、糖组分和细胞器发育等方面与成熟叶明显不同[5]，抗寒性弱于成熟叶片。新梢萌发以后遭遇突然降温的“倒春寒”，对低温非常敏感，非常容易受到伤害。目前，茶树越冬期抗寒性机理取得了系列研究结果，而“倒春寒”响应机理研究则刚刚起步。由于“倒春寒”对茶产业生产的影响更大，因此“茶树对‘倒春寒’的响应机制及其防控技术”在2019年被中国茶叶学会遴选为茶学十大科学问题和工程技术难题之一。

有关茶树抗寒的研究进展前人已有综述[6-8]。本文在前人综述的基础上，吸收最新研究结果，简要回顾茶树抗寒机制取得的研究进展，并结合现代科学技术发展的趋势提出未来的研究重点，供相关研究工作参考。

1 细胞学机制

茶树的越冬期抗寒性与其叶片结构密切相关。抗寒性强的茶树品种叶片具有如下结构特征：叶肉组织发达，分化程度高；叶片总厚度、角质层厚度、上表皮厚度和栅栏组织的厚度大；栅栏组织细胞细长，排列紧密；栅栏组织厚度/海绵组织厚度和栅栏组织厚度/叶肉厚度的比值高[9-11]。生产上阿萨姆变种的抗寒性低于茶变种，也正是由于它们在细胞结构上存在上述的差异[10]。Yue等[12]的研究结果还发现，冷驯化对茶树叶片表面的细胞排列、气孔的开闭等均没有明显的影响，但叶绿体上的变化较明显，冷驯化前的叶绿体中类囊体排列紧密，通过驯化后叶绿体上的类囊体发生解离分散，且嗜锇颗粒增多并在叶绿体上聚集，脱驯化后类囊体又出现堆积，嗜锇颗粒的数量逐渐减少。

2 生理学机制

茶树受到低温胁迫后会发生一系列的生理生化响应，以应对低温的不利影响。生物膜是生物体细胞与外界环境隔离的界面结构，在低温胁迫下生物膜减轻或避免膜脂相变的发生是植物抵御低温的一种重要策略。抗寒性强的茶树品种叶片生物膜结构比较稳定，不易受低温的影响，质膜的透性较小[13]。杨亚军等发现，越冬期抗寒性强的品种‘龙井43’的成熟叶片不饱和脂肪酸指数和亚麻酸（18∶3）比例在冷驯化-低温胁迫-和脱驯化阶段呈现出“低-高-低”的变化趋势，而抗寒性弱的品种‘大叶云峰’则无明显变化规律。还发现低温期间膜蛋白含量在低温胁迫时大幅度上升，且经低温诱导后出现了两种新的蛋白组分，在脱驯化后消失[14]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累损害植物膜系统是低温对植物造成的损伤结果之一，清除ROS能力的高低是茶树品种间抗寒性差异的决定性因素之一[15]。多个研究结果表明，越冬期抗寒性强的茶树品种的抗氧化保护性酶SOD和CAT的活性较高，且抗寒品种SOD同工酶谱带数及同工酶活性具有明显优势[16-18]。胞内可溶性物质的浓度影响着冰晶的形成，其高低决定了细胞的冰点高低和抗寒力的大小。影响胞内可溶性物质含量有两个因素，一是胞内水分的含量和状态，即自由水/束缚水的比例；二是胞内渗透调节物质的类型和含量。在茶树完成冷驯化后，叶片中水分总量和自由水含量下降，束缚水含量上升，束缚水/自由水的比例也升高，与之同步的是胞内渗透调节物质的浓度也升高，如可溶性糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖和棉子糖、甜菜碱、γ-氨基丁酸（GABA）等物质的含量显著增加[12,19-21]，而且在抗寒性不同的品种间存在差异[22-23]。黄海涛等[24]的研究发现，强抗寒性茶树品种的秋季新梢POD活性和可溶性糖含量较高，而弱抗寒性的茶树品种POD活性和可溶性糖含量较低。在低温胁迫条件下，茶树新梢的生长、光合作用、类黄酮合成等次级代谢途径受到显著影响，淀粉代谢增强，以保护新梢免受春季低温危害[25]。

3 分子机制

茶树的抗寒性是一个受多基因控制的复杂遗传性状，解析其调控分子机制对抗寒品种选育和抗寒技术的开发都具有重要意义。进入21世纪以后，随着分子生物学技术的快速发展以及高通量测序技术的普遍应用，特别是“组学”技术为代表的技术手段的应用，茶树抗寒性的分子机制从宏观到微观不同层面取得了一系列研究成果。

3.1 茶树抗寒性分子机制的宏观研究

早期茶树抗寒分子机制的宏观研究主要是基于mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）或者cDNA-AFLP等技术，但由于通量低，分离的差异表达基因少，很难从宏观层面把握抗寒的内在本质[26-28]。随着高通量测序技术应用于茶树抗寒机理研究，推动了抗寒分子机理研究的深入。Wang等[29]率先利用转录组测序（RNA-seq）和数字表达谱（Digital gene expression）技术研究了茶树冷驯化不同阶段的基因表达差异，筛选出1770条在冷驯化/对照和冷驯化/脱驯化两组样品间共同差异表达的基因（differential expression gene，DEG），涉及到冷信号感知与传导、冷响应转录因子、质膜稳定性和渗透响应、ROS的清除等，其中碳水化合物代谢途径和钙离子信号途径在茶树冷驯化诱导抗寒性提高中发挥着核心作用。Li等[30]比较了抗寒的茶变种‘舒茶早’与不抗寒的阿萨姆变种‘英红9号’在冷驯化过程中的基因表达差异，共鉴定出在两个品种间共有的978个DEG，涉及到光合作用、激素信号传导、植物-病原菌互作的转录调控等途径，其中Lhca 2的下调表达和SnRK 2.8的上调表达与‘舒茶早’的抗寒性关系密切。Wang等[15]对不同抗寒性茶树品种的研究发现，除了钙离子信号途径及碳水化合物代谢途径外，调控ROS的产生和清除途径也是茶树适应冷驯化的主要机制之一，而且OST1/SnRK2.6-ICE1、MAPK3-ICE1调控的低温响应过程和活性氧的清除能力是影响茶树品种间冬季低温抗性差异的主要原因。Wu等[31]综合转录组和代谢组研究了冰冻状态下（＜-10℃）茶树叶片与正常生长温度下（15℃）叶片的差异，鉴定出3880个DEG和353个差异代谢物，深入分析发现以MAPK和ABA为中心的Pyr/PYL-PP2CSnRK2信号传导途径在冰冻胁迫下起着重要作用，苯丙烷合成、黄酮和黄酮醇合成、类黄酮合成等3个代谢途径对茶树的抗冻有较大贡献。除了冷驯化以外，茶树也会遇到突然的降温。Hao等[32]利用人工气候室模拟了冷驯化和突然降温过程，并进行了转录组分析，发现冷驯化和突然的降温在分子调控机制上有所区别：细胞壁重组在冷驯化过程中对提高抗寒性具有重要作用，碳代谢和脂肪酸代谢途径是冷驯化过程中的主要代谢途径，而突然降温过程中差异表达基因主要富集在质膜和ROS积累途径上。一些研究认为，茶树叶片表面冰核活性细菌（ice nucleation active bacteria，INA 细菌）的多少也是引起茶树低温冻害的诱因之一[33]。有趣的是，基于重测序和群体分析结果发现，在长期的驯化选择过程中抗寒性强的茶变种抗INA的基因选择强度上远高于不抗寒的阿萨姆变种，这为抗寒品种的选育提供了新的思路[34]。

以上的研究多集中于成熟叶，而新梢的低温响应机制与成熟叶有显著差异。Li等[8]比较了茶树新梢与成熟叶在冷胁迫下的耐寒性和表达谱差异，发现新梢耐寒性远低于成熟叶，细胞膜完整性破坏和光合系统的氧化损伤是造成幼嫩叶片低温伤害的主要原因。通过分析人工模拟“倒春寒”低温胁迫下茶树新梢的转录组和代谢组，确定了多个差异基因富集通路，揭示了MAPK依赖的乙烯信号通路和钙离子信号通路是新梢响应低温胁迫的主要早期信号，随后下游的ICE-CBF-COR低温响应信号途径被激活，从而增加抗寒性[25]。

除了常规的基因表达差异转录调控外，表观调控（DNA甲基化、染色质重塑、miRNA等）、转录后调控（如可变剪切、RNA稳定性、RNA沉默等）也是参与植物低温抗性调控的重要机制[35-36]。Zhang等[37]从‘迎霜’和‘白叶1号’两个品种冷胁迫样品中分别鉴定出31个和46个上调的miRNA、43个和46个下调的miRNA，这些miRNA对应的靶基因涉及到生长发育、转录调控以及胁迫响应等过程，其中miR156、miR159和miR396在不同低温敏感型品种间表现出不同的冷胁迫响应调节模式。Zheng等[38]整合了低温（4℃）和冷冻（-5℃）处理样品的转录组测序（RNA-Seq）和miRNA测序（sRNA-Seq）数据，鉴定出22个与低温响应相关的miRNA-mRNA对。周艳华等[39]研究发现，茶树冷驯化过程中同时发生了甲基化和去甲基化现象，但总体变化趋势表现为甲基化水平的增加，表明DNA甲基化参与了茶树的冷驯化过程。Tong等[40]建立了茶树低温胁迫下的DNA甲基化图谱，与对照相比，在低温处理样品中共鉴定出6 834个DEG和192 869个差异甲基化区段（differentially methylated regions，DRM），在冷响应过程中检测到上调DEG数多于下调的，这与大量的DRM的去甲基化有关。24 519个与DRM相关的基因被鉴定，其中4 338个与鉴定出的DEG重复，GO富集分析发现它们大多与冷胁迫响应有关。有意思的是，3个被研究证实的冷响应基因CsCBF4、CsUGT91Q2和CsbZIP18在冷胁迫过程中上调表达，在它们的启动子和基因本体区域检测到许多去甲基化的基因组区域，而且DNA甲基化在冷胁迫24 h内降到最低，说明DNA甲基化参与茶树冷响应的早期调控。可变剪切（alternative splicing）是一种重要的转录后调控机制，即从前体mRNA中产生一个以上的mRNA转录本，有利于提高植物基因转录和蛋白水平的多样性[41]。Li等[42]绘制了茶树冷驯化过程中可变剪切图谱，发现41%的基因发生了可变剪切，并且可变剪切事件在冷驯化过程中快速上升，而脱驯化后快速下降。值得注意的是，发生可变剪切的差异基因数目在冷驯化过程中逐渐增加，这些基因富集于抗氧化酶系统和糖代谢途径，表明可变剪切事件在茶树冷驯化过程中起着重要作用。染色质可及性（chromatin accessibility）是指核酸大分子能够与染色质上的DNA进行物理接触的程度，由核小体的占据度和拓扑组织以及染色质结合因子与DNA的结合来决定，在生长发育及外界刺激过程中呈现动态变化，是一种重要的表观基因组表达调控指标[43]。一项研究绘制了首张冷胁迫下茶树的染色质可及性和翻译组图谱，发现冷胁迫在转录和翻译两个水平影响茶树的翻译效率，一批基因在转录和翻译水平快速响应冷胁迫，为了解茶树灵活响应冷胁迫的基因表达调控提供了新的视角[44]。

3.2 茶树抗寒相关基因鉴定及功能研究

茶树对低温胁迫的响应以及抗性的形成，无论是细胞学层面还是生理生化层面，最根本的原因还是受到抗寒相关基因及其调控单元的控制。因此，对抗寒相关基因的鉴定及其功能的研究是茶树抗寒分子机制研究的重点之一。

3.2.1 信号感知与传导相关基因

感知低温胁迫信号进而传导到下游以启动防御机制是植物抵抗低温的第一步。钙离子（Ca2+）作为第二信使，在植物中参与许多生物学过程。植物对低温信号的初始反应可能是细胞膜上的Ca2+通道，当受到低温刺激后植物细胞内的Ca2+浓度在短时间内迅速增加，从而激发下游耐寒防御反应。课题组前期的研究也发现钙离子信号通路在茶树低温响应中起着关键作用，随后茶树钙离子信号通路的关键基因如钙调素蛋白（calmodulin proteins, CaMs）和类钙调蛋白（CaM-like, CMLs）家族、钙调磷酸酶B 类似蛋白（calcineurin B-like, CBL）家族和钙依赖性蛋白激酶家族（calcium-dependent protein kinase，CPKs）等陆续被鉴定出来。黄玉婷等[45]克隆到2个钙调素蛋白CsCaM 1和CsCaM 2，二者的表达受低温和CaCl2处理诱导上调，而受钙调素拮抗剂W7和钙离子通道抑制剂LaCl3抑制。在已克隆的CsCML基因中，CsCML16、CsCML18-2和CsCML42受低温显著诱导[46-47]。通过鉴定茶树中26个钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CPK） 基 因家族成员，发现低温胁迫抑制了10个CsCPKs基因的表达，而14个CsCPKs基因则至少在低温处理的某一阶段被诱导上调表达[48]。对其中一个基因CsCPK9的功能进行鉴定，发现其正调控植物的抗寒性（未发表数据）。对8个CsCBLs和25个CsCIPKs基因的表达及蛋白互作鉴定发现，CBL-CIPK模块介导的茶树新梢和成熟叶的低温响应存在不同的机制，CsCBL9-CsCIPK14b和CsCBL9-CsCIPK1/10b/12/14b可能分别调节茶树新梢和成熟叶的低温响应[49]。

3.2.2 茶树ICE-CBF-COR途径相关基因

ICE-CBF/DREB-COR信号途径在诱导植物抗寒响应方面起着关键作用，也是植物低温响应信号调控网络中研究得最清晰的一条途径。低温条件下，ICE转录因子通过特异地结合CBF/DREB1基因启动子中的MYC元件（CANNTG）来调控CBF/DREB1基因的转录[50]。随后，被激活的CBF/DREB1与许多低温调控基因COR启动子中的CRT/DRE元件（CCGAC）结合，以促进COR基因的表达来提高植物抗寒能力[51]。茶树中克隆了1个CsICE1和6个CsCBF基因，与模式植物类似，CsICE1的表达基本上呈现组成型表达模式，而CsCBFs表达均受低温处理显著上调，且CsCBF1-3的表达在低温处理1 d内上调了超过100倍甚至1000倍。过表达CsCBF3能通过ABA非依赖性途径增强转基因拟南芥的抗寒能力[52-53]。最新的研究发现，CsICE1正调控CsCBF1和CsCBF3，但对CsCBF 2和CsCBF 5没有调控作用。此外，CsWRKY 4 和 CsOCP 3 都能与 CsICE 1 相互作用并调节CsCBF1/3的转录，从而介导茶树的胁迫响应[54]。CORs即低温调节或低温响应基因，分为受CBF调控和不受CBF调控两类。茶树中已有多个CsCORs被鉴定，如Wang等[55]从低温处理茶树中鉴定到10个上调表达的CsCORs，其主要编码锌指蛋白、细胞结构蛋白、甘氨酸丰富蛋白、早期光诱导蛋白、β-淀粉酶、查尔酮合酶和黄酮醇合酶等。转录组分析鉴定出很多CsCORs基因，如β-1,3-葡聚糖酶相关基因（GLPs）、几丁质酶相关基因（CLPs）、胚胎后期发生丰富蛋白相关基因（LEAs）等都受低温诱导上调表达[29]。β-淀粉酶（BAM）是植物中参与淀粉水解的关键酶类，郝心愿等[56]克隆了茶树β-淀粉酶基因CsBAM3，发现它在成熟叶冷驯化初期即被显著上调且一直保持较高表达水平，在新梢中也被低温快速诱导表达，与前期发现冷驯化期间淀粉水解的结果吻合。从茶树基因组中鉴定出48个CsLEAs基因，其中47个基因在低温处理不同时间点差异表达，特别是CsLEA13/21/24/32/45受低温处理诱导显著上调表达[57]。这些基因资源的鉴定为解析茶树抗寒机理和培育抗寒品种提供了素材。有意思的是，茶树的一个CsCOR基因中具有两种不同的可变剪接转录产物CsCOR-1和CsCOR-2，其中CsCOR-1在冷驯化期间受低温诱导上调[42]。

3.2.3 碳水化合物代谢途径相关基因

如前所述，无论是在成熟叶还是在新梢中，碳水化合物代谢途径在茶树低温响应中都起着重要的作用。因此，对该途径的基因鉴定及功能研究是茶树抗寒研究的重点之一。Yue等[12]通过分析自然冷驯化过程中59个与淀粉代谢、可溶性糖代谢、糖转运及糖信号转导相关的基因的表达模式，发现多个基因（如CsINVs、CsSnRK1.2、CsHXK3、CsSWEETs和CsBAM3等）受低温调控，并提出了一个糖介导的茶树低温胁迫响应调节模型。随后，Qian等[58-59]明确了7个低温诱导的转化酶基因（CsINVs），并通过在拟南芥中过表达CsINV5，阐明其能促进蔗糖水解，提高相应的己糖与蔗糖的比例，增强转基因拟南芥的抗寒能力。Li等[60]明确了己糖激酶基因CsHXK1/3/4受低温诱导显著上调表达，而CsHXK 2和果糖激酶基因CsFRK6/7则受低温胁迫显著抑制。在糖转运体方面，冷驯化和低温胁迫条件下己糖转运体基因CsSWEET1a/1b/2a/9b/17都有不同程度的上调表达，而CsSWEET16受低温胁迫抑制。功能鉴定表明，CsSWEET16是液泡膜糖转运体，它在低温条件下通过调控液泡膜内外的糖分配来增强转基因拟南芥的抗寒性。CsSWEET1a和CsSWEET17是细胞膜糖转运体，二者在细胞膜上互作介导质膜内外的糖转运来提高植物的抗冻能力[61-62]。

3.2.4 抗氧化途径相关基因

低温导致的氧化损伤是造成茶树低温伤害的主要原因之一，抗氧化能力在茶树抵御低温胁迫中非常重要。近几年，茶树的挥发性物质有效调控抗寒性的研究取得重要进展。糖基转移酶CsUGT91Q2特异性催化橙花叔醇的糖基化，使低温环境下茶树体内的橙花叔醇糖苷大量积累，有效地清除低温胁迫诱导产生的ROS，提高茶树抗寒性[63]。类似的，CsUGT78A14和CsUGT71A59分别催化黄酮醇和丁香酚的糖基化，提高ROS清除能力，正调控茶树的抗寒性[64-65]。

3.2.5 茶树低温响应相关转录因子基因

转录因子是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用调控目的基因表达时间和强度的蛋白质分子。植物中已鉴定到超过80个转录因子家族基因。茶树上，除了CBF和ICE外，许多转录因子也已被报道参与了茶树的低温响应过程，如WRKY[66-67]、bHLH[68]、bZIP[69]和Hsf[70]等。一些转录因子的功能通过模式植物进行了异源功能鉴定。茶树的两个bZIP转录因子负调控植物的抗寒性，其中CsbZIP6过表达植株中大多数低温响应基因和淀粉代谢相关基因的表达均受低温抑制[71]，而CsbZIP18在拟南芥中过表达是通过抑制ABA途径相关基因的表达在冷冻胁迫中起负调控作用[72]。

4 展望

进入后基因组学时代以来，对复杂性状的研究已经从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究，生命科学研究进入生物学2.0时代[73]。近十年来，随着多组学技术的应用以及茶树全基因组测序的完成，茶树基因的发掘变得越来越便捷和快速，一大批低温响应基因被克隆，相关的调控途径也陆续被发现，这些研究结果丰富了茶树低温响应基因资源库，推动了对阐明茶树抗寒机制起到了促进作用。但是由于茶树缺乏基因同源鉴定技术，使得目前的大多数研究仍停留在基因的克隆及表达模式分析上，少数通过异源转化拟南芥等模式植物进行单基因的功能鉴定，然而茶树和模式植物的代谢模式及生长发育调控存在较大差异，异源鉴定的结果不足以支撑茶树本体基因的功能，也无法实现对基因调控单元或网络的准确鉴定。另外，以前的研究结果大多数集中于茶树的越冬期抗性机制研究，对幼嫩新梢抗寒机制的研究较少。而产业需求最大的则是新梢抵抗“倒春寒”防治技术的研发。因此，今后茶树抗寒的研究应重点布局以下几个方面：

找到茶树快速感受低温的“温度感受器”。生物激发对温度胁迫响应的第一关是快速感受温度的变化，这个过程需要通过温度感受器来实现。动物细胞主要通过膜上的TRP家族离子通道作为温度的感知受体[74]，但植物基因组上并未发现TRP基因。多个研究结果发现，植物的“温度感受器”不是唯一的[75]。目前茶树的低温感受器并不清楚。寻找到茶树快速感受低温的“温度感受器”这个“开关”，对于揭示茶树抗寒响应机制至关重要。

抗寒基因的功能鉴定及其调控模块的发掘与调控网络解析。抗寒能力提升的本质是各种抗寒基因及其调控网络共同发挥作用产生的综合结果，解析每个基因及其调控单元的功能与调控机制进而建立调控网络是解开茶树抗寒机制本质最主要的内容。这需要建立成熟的茶树基因功能同源鉴定技术，包括遗传转化、RNAi、VIGS（virus-induced gene silencing）或者最新的基因编辑技术等，以及利用多组学（multi-omics）技术的系统生物学研究方法的应用。

抗寒分子标记的发掘及关键抗寒代谢物质的鉴定。对于越冬期抗寒来说，种植抗寒品种仍然是最经济有效的手段。随着极端天气的频繁发生，选育抗寒品种还是茶树育种的重要目标之一。运用全基因组关联分析等高通量技术手段定位控制抗寒的QTL、发掘等位基因和变异位点并转化为可信的分子标记，实现抗寒的早期鉴定，对推动抗寒育种意义重大。

攻克“倒春寒”防控的技术瓶颈。作为困扰茶学研究和产业的难点之一，解析茶树新梢快速响应“倒春寒”的机制并开发防治技术将是未来茶树抗寒研究的重点和难点。研究表明，一些次生代谢物能影响植物的抗寒性，而茶树有着比模式植物更为丰富的次生代谢物质。Zhao等[63]研究发现，在低温环境下，作为茶树重要的香气物质之一的橙花叔醇糖苷大量积累，可以有效地清除低温胁迫诱导产生的活性氧；橙花叔醇也可作为信号物质激发茶树体内的冷防御机制，从而提高茶树的抗寒性。该项研究结果为我们解决“倒春寒”难题提供了新思路。从茶树中鉴定出能快速调控新梢抗寒性的代谢物，进而开发绿色可行的防控技术和产品将是未来解决茶树“倒春寒”的途径之一。