董 浩，黄俊源，何昀桐，冼燕萍，白卫东，曾晓房*

（1 仲恺农业工程学院轻工食品学院 广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室 现代农业工程创新研究院农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室 广州 510225 2 广州质量监督检测研究院 食品安全预警研发中心 广州 510447）

杂环胺（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）主要是由含有丰富蛋白的食品在较高温度及长时间的加工过程中产生的一种潜在的致癌物[1-3]。人体若长期或过量摄入，易增加患癌风险[4-5]。近年来杂环胺对人体的危害已成为一个备受关注的问题[6-7]。杂环胺分为氨基咪唑氮杂芳烃 （Aminoimidazoazaarenes，AIAs）和氨基咔啉（Amino-carbolines）两大类型[8-10]。7 种常见的氨基咔琳类杂环胺（非极性杂环胺）化学结构见图1。

图1 7 种非极性杂环胺的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of 7 nonpolar HAAs

广式烧鹅是广东的传统美食之一，其烹饪过程极易产生杂环胺，因此，对其杂环胺检测方法的研究就显得尤为必要。目前杂环胺的检测方法虽有很多，但都存在一些的缺点和不足[11]。比如：当采用气相色谱法和气相色谱-质谱法时，杂环胺容易因呈极性和不易挥发的特性而吸附在色谱柱和进样器上，导致出现峰展宽和拖尾等峰形恶化问题，虽然气相色谱-质谱法解决了低浓度杂环胺不易检出的问题[12]，但是仍需将样品衍生化，使前处理更加复杂。液相色谱法是最常见的分析方法，它的缺点是选择性差，灵敏度低。高效液相色谱-四极杆-静电场轨道肼高分辨质谱 （HPLC-Q-Orbitrap HRMS）的Orbitrap MS 质量分辨率、灵敏度都较好，并且能够测定精确的相对分子质量[13]，可以根据检测要求，反复调用在全扫描模式下采集的数据，经依赖性扫描（Data-dependent scan）可以获得高质量的二级碎片质谱图，实现对未知风险物质的非定向筛查和对已知风险物质的准确定性，弥补了传统低分辨质谱方法（液相色谱-质谱/质谱法）只能测定已知化合物的局限性。近年来，食品安全检测、蛋白组学等方面的应用研究方兴未艾[14-16]。

本文利用HPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术，建立7 种非极性杂环胺基于正离子模式下的一级母离子的精确质量数、高质量二级碎片质谱图和保留时间等相关数据，以及7 种非极性杂环胺的MS/MS 谱库。针对广式烧鹅的特性，优化样品提取和净化等前处理条件，采用HPLC-Q-Orbitrap HRMS 正离子全扫描模式，通过提取的二级质谱图，与上述MS/MS 谱库比较定性，以一级质谱的精确相对分子质量峰面积与标准品比较定量，建立广式烧鹅中非极性杂环胺的筛查定性及定量检测方法。应用此检测方法，抽取市场上部分广式烧鹅的不同部位，进行非极性杂环胺的检测，发现存在非极性杂环胺化合物的暴露风险。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准物质：7 种非极性杂环胺的中文名称和英文缩写见表1，购自上海ANPEL 公司；乙腈、甲酸、乙酸铵均为色谱纯级，德国CNW Technologies GmbH。

1.2 主要仪器及设备

超高效液相色谱-质谱联用系统（该系统包含4 个主要部分，即自动进样器、柱温箱以及德国Thermofisher Scientific 的Orbitrap 高分辨质谱）；利用XCalibur 4.0 软件控制质谱仪，以及后期的数据处理。色谱柱Thermo Accucore aQ C18（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）。MS3 digital 涡旋混合器，艾卡（广州）仪器设备有限公司；KDC-40 低速离心机，安徽中科中佳仪器有限公司；N-EVAP 112 水浴氮吹仪，Organomation 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品制备 参考文献[17]的方法配制标准品。

1.3.2 样品制备 试验所用的烧鹅产品（A～D）全部购自广州当地具有一定知名度的饭店和烧腊店。分别采集鹅胸、鹅翅、鹅腩、鹅腿4 个部位，将皮和肉分开处理，分别用绞肉机绞碎，在-18 ℃下贮存待用。

1.3.3 样品提取 参考文献[17]的方法进行样品提取。

1.3.4 样品净化 参考文献[17]的方法进行样品净化。

1.3.5 液相色谱-质谱联用测定条件 液相色谱-质谱联用测定条件参考文献[17]的方法。

2 结果与分析

2.1 色谱条件和质谱定性、定量分析

7 种非极性杂环胺在ESI+模式下，均得到[M+H]+的准分子离子峰；乙腈和甲醇是2 种优良的极性有机溶剂，常用作反相液相色谱的流动相，而乙腈的黏度更低，压力更小，洗脱效率更高；在水相流动相中加入乙酸铵和甲酸分别达到了改善峰形和提高离子化效率的目的[16]；梯度洗脱可以实现7种目标杂环胺的良好分离。因此经反复试验，优化出材料与方法中的色谱条件。根据获得的7 种非极性杂环胺的一级高分辨质谱图（均为[M+H]+），以及从提取一级母离子中获取的提取离子流色谱图，得到如表1所示结果。

表1 7 种杂环胺的保留时间和准确质量数测定数据Table 1 Determination data of retention time and accurate mass number of 7 HAAs

另外，试验还得到了7 种非极性杂环胺的二级高分辨质谱图（图2），根据谱图中显示的主要特征碎片，构建标准谱库。在实际样品检测中，该标准谱库可进行匹配、检索，从而达到筛查的目的，更有利于定性分析的进一步确定。同时，在筛查非靶向杂环胺时，利用拥有较高精度的质量数和特征碎片的离子，大大减少了可能的分子式组成数，从而能够更好的推测化合物的分子式或结构，提升筛查效率。通过进一步收集杂环胺标准物质，逐步完善杂环胺的液质质谱库，为肉制品中杂环胺的筛查和安全风险水平评估提供技术支撑。

图2 7 种非极性杂环胺的质谱图Fig.2 Mass spectrogram of 7 nonpolar HAAs

2.2 提取方法的优化

常见的提取溶剂包括乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇[18]。在这些提取溶剂中，乙腈的优点是极性范围大，相对分子质量较小，因而具有较强的组织穿透能力，拥有良好的沉淀效果[18]。

加入碱性溶液能加快样品的分散速度，使目标化合物更充分地被提取[19]。同时为了有效抑制杂环胺的电离，调整了目标物在水相-有机相之间盐析时的分配比，提高了其向乙腈层转移的效率。本文考察了不同浓度的NaOH 溶液对目标杂环胺提取效率的影响。在不同NaOH 浓度下，7 种非极性杂环胺的提取回收率见图3a。在碱性条件下，随着NaOH 浓度的升高，7 种非极性杂环胺的回收率整体呈上升趋势，在1 mol/L 时的回收率最佳。当NaOH 溶液浓度为1 mol/L 时，在氮吹过程中，提取溶液并不浑浊，表明油脂提取出的量少，原因可能是NaOH 使部分油脂发生了皂化水解反应，起到了一定的除脂效果。故最终采用1 mol/L的NaOH 溶液搭配乙腈作为提取溶剂。

由于NaCl 盐析效应在固相萃取过程中对萃取效率有显著影响，因此研究了0，1.0，1.5，2.0，3.0 g 的NaCl 添加量对7 种非极性杂环胺提取效果的影响，结果如图3b 所示。可以看出，在不添加NaCl 的情况下，杂环胺AαC、Trp-P-1、Trp-P-2 的回收率较差（＜60%）。当NaCl 添加量为1.0 g 时，杂环胺的提取回收率均有一定程度提高，而AαC与Trp-P-1 的回收率仍在70%以下；当NaCl 添加量增加到1.5 g 时，7 种杂环胺的提取回收率均在80%～120%之间。当NaCl 添加量继续增加时，对杂环胺的提取回收率的变化无太大影响。因此，为获得较优的杂环胺提取回收率，最终选择NaCl 添加量为1.5 g。

图3 不同NaOH 浓度（a）和不同NaCl 添加量（b）对7 种非极性杂环胺提取回收率的影响Fig.3 Effect of different concentration of NaOH solution （a） and different NaCl addition （b） on extraction recoveries of 7 nonpolar HAAs

2.3 净化条件的优化

研究了2 种固相萃取柱 （StrataTM-X-C，60 mg/3 mL；PCX，60 mg/3 mL）和不使用固相萃取柱的情况，进行比较和测试。7 种杂环胺的提取回收率结果如图4a 所示。从图4a 可以看出，采用StrataTM-X-C 和PCX 净化，各种非极性杂环胺均可获得较好的回收率。StrataTM-X-C 是一种强阳离子交换柱，其键合了苯磺酸官能团与杂环胺上的-N+可形成较强的离子键，通过水和甲醇的充分淋洗除杂，Harman、AαC、MeAαC 3 种非极性杂环胺的回收率优于使用PCX 固相萃取柱。综上，采用StrataTM-X-C 固相萃取柱对提取溶液进行净化，能提高待测杂环的提取回收率。

本文还研究了甲醇-氨水混合洗脱液的体积比对7 种非极性杂环胺提取回收率的影响，结果如图4b 所示。当氨水的体积分数从5%增加到10%时，大多数非极性杂环胺的提取回收率均有一定程度的上升，而当氨水的体积分数持续增加时，部分杂环胺的回收率有不同程度的降低。在体积比为90∶10 的甲醇-氨水洗脱液下，杂环胺的整体回收率最优。因此，本研究的固相萃取柱洗脱溶液最终确定甲醇-氨水的体积比为90∶10。

图4 不同固相萃取柱（a）和洗脱液中甲醇与氨水的体积比（b）对7 种非极性杂环胺提取回收率的影响Fig.4 Effects of different solid phase extraction columns （a） and volume ratio of methanol to ammonia （b）in eluent on extraction recoveries of 7 nonpolar HAAs

2.4 方法学考察

用甲醇将标准储备溶液连续稀释至0.05，0.5，1.0，2.0，5.0，10，20，50，100 μg/L 的混合标准工作液，每个质量浓度测定3 次，以参考文献[17]的方法进行分析，得到线性回归方程、检出限和定量限。如表2所示，Trp-P-2 和Phe-p-1 在0.5～100 μg/L 质量浓度范围内，AαC 在0.1～50 μg/L质量浓度范围内，其余5 种杂环胺在0.1～100 μg/L 质量浓度范围内，具有较好的线性关系，其相关系数分布在0.996～0.9997 之间。方法检出限确定在0.02～0.15 μg/kg 之间，而方法定量限在0.05～0.5 μg/kg 之间，因此说明本方法具有良好的线性关系和较高的灵敏度。

表2 7 种杂环胺的相关检测数据Table 2 Related detection data of 7 HAAs

均匀混合3 种部位的烧鹅肉样品，进行加标回收试验，LOQ 添加水平倍数为1，2 和10，对3个添加水平进行6 次平行试验（n=6），选取中间添加水平连续试验5 d（n=5），外标法定量，其回收率和精密度的结果如表3所示，可以得出7 种极性杂环胺的回收率在71.3%～111.5%之间，日内精密度RSD（n=6）在2.2%～6.8%之间，日间精密度RSD（n=5）在2.9%～5.8%之间，表明本方法的回收率和精密度良好。

表3 杂环胺的回收率、日内和日间精密度Table 3 Recoveries，intra-day precision and inter-day precision of HAAs

2.5 实际样品检测

分别取A、B、C、D 4 家饭店烧鹅的鹅胸、鹅翅、鹅腩、鹅腿的皮和肉，采用本文建立的HPLCQ-Orbitrap HRMS 方法对广式烧鹅中的7 种杂环胺进行检测，结果见图5。从图5可以看出，广式烧鹅各个部位样品中均能检测出HAAs。由图5可知，HAAs 污染水平顺序为鹅腩＞鹅腿＞鹅胸＞鹅翅，原因可能与各个部位的油脂含量不同有关。由图5还可知，HAAs 污染水平呈现皮＞肉的现象，原因可能是，鹅皮比鹅肉脂肪含量更多，而且在加工过程中，皮直接接触外界高温更容易产生杂环胺，因此皮中HAAs 的含量远远大于肉。

图5 广式烧鹅中不同部位的7 种杂环胺总含量Fig.5 Total contents of 7 HAAs in different parts of Cantonese roast goose

3 结论

本文采用高效液相色谱-四极杆-静电场轨道肼高分辨质谱技术，建立了广式烧鹅中7 种非极性HAAs 的检测方法。确立了样品前处理的最优方案：样品中添加1.5 g 的NaCl，用1 mol/L 的NaOH 溶液和乙腈进行提取和均质后，再使用StartaTM-X-C 固相萃取柱进行净化，最后使用体积比90∶10 的甲醇-氨水作为洗脱液洗脱，最后采用C18 色谱柱对杂环胺进行分离，以乙腈-1 mol/L 乙酸铵溶液（含0.05%甲酸）为流动相，在电喷雾正离子、全扫描和数据依赖性扫描模式下检测，以保留时间、一级离子质量准确度、二级碎片与库匹配准确定性，以一级离子峰面积结合内标法定量。7种HAAs 在0.1～100 μg/L 的线性范围内线性关系良好，该方法灵敏度高，回收率和精密度良好，适用于在中国传统美食广式烧鹅中7 种HAAs 的筛选和定量检测。实际样品检测结果表明，鹅皮的HAAs 含量远远大于鹅肉，可能由于皮中所含蛋白质、油脂等较多所致，符合形成杂环胺前体物质的内容物含量。同时，该方法可以进一步应用于其它加工肉类产品中HAAs 的检测，可为肉类产品中HAAs 的形成和抑制研究提供方法学基础。