任晨吟 付益修

1.杭州医学院临床医学院，浙江杭州 310053；2.杭州医学院基础医学与法医学院，浙江杭州 310053

抗生素耐药性的演变是一个自然过程，是病原微生物与环境相互作用的预期结果。2017 年世界卫生组织公布了首份亟需新型抗生素治疗的重点病原体清单，其中大肠埃希菌排名第三位。大肠埃希菌作为临床分离株中最常见的细菌，可以分为共生菌和致病菌，其中致病菌又可以分为肠道致病大肠埃希菌（entero pathogenicEscherichia coli，DPEC）和肠道外致病大肠埃希菌（extraintestinal pathogenicEscherichia coli，Ex-PEC）[1]。DPEC 大多为机会致病菌，在免疫力低下人群中可引起严重后果。另外，近年来ExPEC 感染率呈上升趋势[2]，在临床上引起尿路、腹腔、肺部、皮肤和软组织感染，菌血症，新生儿脑膜炎等病症[3]。耐药性大肠埃希菌在临床上的普遍性及其引起的严重后果应当引起重视。研究发现不同感染性疾病中分离的大肠埃希菌抗生素耐药性的结果也不同。为此，本文对临床常见的大肠埃希菌耐药现状、耐药机制及治疗方法等几个方面的研究进行综述。

1 致病性大肠埃希菌抗生素耐药现状

临床上常见的致病性大肠埃希菌分离株有尿路致病性大肠埃希菌（urinary tract pathogenicEscherichia coli，UPEC）、侵入性大肠埃希菌（invasiveEscherichia coli，EIEC）、产志贺毒素大肠埃希菌（shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC）、弥散黏附性大肠埃希菌（diffuse adhesiveEscherichia coli，DAEC）、肠集聚性大肠埃希菌[1]。UPEC 作为临床上常见的ExPEC，可从正常肠道菌群转移至泌尿道并持续表达各种毒力因子，因而引起泌尿系统疾病。近年来，UPEC 抗生素耐药现状严峻，特别是第三代头孢菌素和氟喹诺酮类抗生素耐药性显著增加[4]。2018 年，Raeispour等[5]发现从伊朗德黑兰尿路感染患者中分离出的多数大肠埃希菌对头孢菌素类抗生素产生耐药，其中对头孢吡肟耐药率已经高达100%。巴斯德研究所Shahbazi等[6]分离的UPEC 对氨苄西林耐药率达78.3%。2020 年，Sun等[7]发现UPEC 对氨苄西林耐药率高达100%，四环素耐药率达96.4%，头孢唑啉、头孢噻肟等抗生素耐药率大于92.0%，上述研究表明，UPEC 的耐药率呈逐年上升趋势，耐药抗生素种类不断增加。此外，EIEC感染性强，可通过血脑屏障侵入脑脊液，从而产生严重后果，临床多见脓毒菌血症和新生儿脑膜炎等疾病。Begier等[8]分析了美国2009—2016 年入院就诊患者分离出的EIEC 数据，表明人群对EIEC 的感染率不断上升，并发现EIEC 对超广谱头孢菌素的耐药性呈增加趋势。STEC 是一种肠道病原体，可导致人患多种胃肠道疾病。Rubab等[9]对取自人类的40 株菌株进行了圆盘扩散法检测，结果显示74.5%的大肠埃希菌分离株对50%的测试抗生素具有耐药性。所有菌株都对甲氧西林、青霉素、红霉素、万古霉素耐药，其中98%的菌株对庆大霉素耐药。在发展中国家，腹泻是尤为严重的胃肠道健康问题。研究表明，DAEC 的感染是导致腹泻的重要原因。Javadi等[10]调查伊朗南部某医院DAEC 的流行率和抗生素耐药性，在66.9%的粪便样本中检测出大肠埃希菌，并对腹泻性DAEC 分离株进行了11 种抗生素的药敏试验，其中所测DAEC 对氨苄青霉素全部耐药，92.8%的DAEC 株对亚胺培南敏感。抗生素的不规范使用，不仅使同一种致病性大肠埃希菌对多种抗生素耐药，又使耐药的致病性大肠埃希菌种类增加。致病性大肠埃希菌的耐药形势严重。

2 致病性大肠埃希菌的耐药机制

2.1 移动遗传元件

移动遗传元件包括质粒、整合子和转座子。多重耐药性大肠埃希菌菌株的流行率不断增长，移动遗传元件（mobile genetic element，MGE）中的抗生素抗性基因（antibiotic resistance gene，ARG）的出现是重要原因之一[11]。质粒介导的抗生素抗性基因的持续进化和替代导致了新酶的出现和耐药性的水平传播[12]。目前，大肠埃希菌中发现最多的是超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-Lactamase，ESBLs）。Asadi Karam等[13]对β-内酰胺类抗生素耐药的尿路致病性大肠埃希菌基因序列进行分析，发现其耐药的主要机制是bla-TEM、bla-SHV 和bla-CTX-M 基因编码β-内酰胺酶，其中TEM-1、TEM-2、SHV-1 基因占主导作用；另外，由质粒编码的五肽重复序列蛋白Qnr 可保护DNA 旋转酶和拓扑异构酶免受喹诺酮类药物破坏的耐药机制也已引起重视。整合子由整合酶基因（intl）、相关重组位点（atll）、基因盒（GCs）和启动子（Pc）组成[12]。整合子多功能结构使其可以捕获，整合，转录外源基因，最终导致水平基因的转移，从而介导细菌耐药性的形成[11]。根据整合酶基因进行分类，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子与细菌耐药性有关，其中Ⅰ类整合子可捕获大量来自抗生素抗性基因库的基因盒，成为临床最常见的整合子，Ⅰ类整合子在UPEC 分离株中流行率达47%[14]。另外，转座子可借助细菌染色体、噬菌体或质粒复制插入或转移ARG[15]。

2.2 靶点突变及修饰

细菌表面有各种抗菌药物的结合位点，当这些结合位点的靶蛋白发生突变或经一些酶修饰后使抗菌药物无法识别而失活，从而产生耐药性。青霉素结合蛋白（Penicillin binding protein，PBPs）结构改变或合成量增多都可以导致细菌对β 内酰胺类抗生素产生耐药性[16]；DNA 促旋酶GyrA 基因突变导致Ser83 位点的氨基酸改变，酶和药物的亲和力下降，从而导致细菌对喹诺酮类抗生素产生耐药性；16sRNA 甲基化酶修饰30S 核糖体亚基导致氨基苷类抗生素无法与核糖体结合抑制蛋白质的合成达到杀菌效果从而使细菌产生耐药性[7]。由此可见，抗生素靶点的结构及数量变化都可以引起抗生素耐药性。

2.3 灭活酶

目前研究较多的抗生素灭活酶主要包括β-内酰胺酶和氨基苷类的钝化酶。β-内酰胺酶是耐β-内酰胺类抗生素细菌产生的能使药物结构中的β-内酰胺环水解从而失去活性的一类酶。从1940 年发现至今已达200 多种，根据BJM 分类法以酶作用底物是否相同、是否被酶抑制剂抑制分为4 大类11 小类。目前ESBLs 备受关注，这类酶能够水解头孢菌素如头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟[17]。Asadi Karam等[13]发现产ESBLs 尿路致病性大肠埃希菌分离株对β-内酰胺类、氨基苷类和喹诺酮类的耐药率都很高。另外，细菌产生的钝化酶可以灭活氨基苷类抗生素，钝化酶包括氨基糖苷类乙酰转移酶、氨基糖苷类核苷转移酶和氨基糖苷类磷酸转移酶，它们分别将乙酰基、腺苷、磷酸连接到氨基苷类抗生素的氨基或羟基上，使药物不能与核糖体结合而失效[7]。

致病大肠埃希菌的耐药机制复杂，除上述抗性基因的出现、抗生素靶点的变化及灭活酶等机制以外，外排泵系统、细胞膜通透性的改变及生物膜都可使大肠埃希菌产生耐药性。AcrAB-TolC RND 外排泵介导大肠埃希菌对β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类以及氟喹诺酮类抗生素的天然耐药性[18]。生物膜（biofilm，BF）是细菌附着在机体体腔或生物材料表面并分泌多糖蛋白复合物将自身包裹的黏液层[15,19]。生物膜既可以形成物理屏障产生抗生素耐药，又通过协同作用诱导基因产生特异的表型影响抗生素活性。研究表明，产生生物膜的大肠埃希菌的抗生素耐药性明显高于不产生生物膜的大肠埃希菌[20]。

3 致病性大肠埃希菌耐药菌株治疗方法

致病性大肠埃希菌耐药菌株的出现给感染性疾病的预防治疗提出挑战。为缓解致病性大肠埃希菌的耐药现状，应遵循抗菌药物临床应用指导原则[21]，此外，也应拓展新的非抗生素治疗方式。

3.1 CRISPR-Cas9 系统

CRISPR-Cas9 系统利用噬菌体有效递送编码sgRNA 和Cas9 的基因，其中sgRNA 与靶基因序列互补，可选择性地定位于靶基因上，结合Cas9 蛋白的核酸内切酶活性，当靶基因位于耐药质粒上，Cas9 蛋白的切割会导致质粒丢失，使耐药菌再敏化；当靶基因位于细菌基因组上时，Cas9 蛋白的切割会导致双链断裂，直接使耐药菌死亡[22]。目前，CRISPR-Cas9 系统已在细菌耐药领域取得较大进展。Kim等[23]应用CRISPR-Cas9 系统杀死产ESBLs 大肠埃希菌。Hao等[24]基于CRISPR-Cas9 系统，靶向耐碳青霉烯酶大肠埃希菌中耐药基因或质粒，使其恢复对碳青霉烯类抗生素的敏感性。

3.2 中药

研究表明，中药可以产生抗菌作用且不易产生耐药性或降低已有的耐药性[25]。李海华等[26]对45 味中药进行了多重耐药大肠埃希菌的抑菌效果检测，发现大肠埃希菌对博落回、黄连、五味子等十味中药高度敏感。在某单味中药存有抗菌作用的基础上，与其他中药制备成方剂效果更佳，宁官保等[27]发现黄连若与其他中药制备成三黄汤和黄连解毒汤，对大肠埃希菌耐药性消除率高于单味中药，并可以抑制ESBLs 的活性，从而降低致病性大肠埃希菌的耐药性[28]。此外，中药复方清热颗粒可增加孔蛋白OmpF 改变细胞膜通透性[29]，川贝母可抑制多重耐药大肠埃希菌生成生物膜[30]，两者在联合抗生素使用的情况下，可使抗生素充分发挥效能，降低致病性大肠埃希菌的耐药性。

除上述CRISPR-Cas 系统、中药等新的非抗生素疗法以外，噬菌体-抗生素的联合疗法、光动力疗法也都具有良好的应用前景[31]。Moradpour等[32]对耐药大肠埃希菌0157 采用了噬菌体-抗生素联合疗法，两者协同抑制大肠埃希菌耐药性的产生。另外，有研究表明，光动力疗法通过破坏抗生素灭活酶、外排泵系统或者改变抗生素靶点、ARG，还原大肠埃希菌对抗生素的敏感性[33]。Feng等[34]首次证明，使用抗菌光动力疗法可以防止碳青霉烯类抗生素被碳青霉烯酶降解，从而实现产生碳青霉烯酶的耐药菌对碳青霉烯类抗生素再敏感化。

4 讨论

致病性大肠埃希菌作为临床上常见的致病菌，可引起多种组织器官的感染。致病性大肠埃希菌抗生素耐药状况日益严重，耐药致病性大肠埃希菌种类增加，并出现一种致病性大肠埃希菌对多种抗生素耐药的现状。致病性大肠埃希菌耐药机制复杂，移动遗传元件、灭活酶、药物靶点的突变或修饰均可介导致病性大肠埃希菌耐药的发生，但耐药机制的新研究也为新药研发提供了方向。在后抗生素时代，新型抗生素的研发速度缓慢，耐药致病性大肠埃希菌的出现给临床治疗提供了新的挑战，随着中药学、分子生物学的发展及多学科交叉融合，研究人员提出了许多新型的抗菌方法，CRISPR-Cas 系统为耐药致病性大肠埃希菌抗生素再敏感化提供了新机会，中药在耐药致病性大肠埃希菌的治疗中表现出良好的作用，这些新方法新技术为治疗耐药致病性大肠埃希菌感染性疾病指明新方向，但将这些新方法运用到临床，还需要更多的研究及努力。