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基于TGF-β/Smad7信号通路探讨针灸对大鼠溃疡性结肠炎的影响※

2022-11-21曾于恒林丽珠吴小云

中医药通报 2022年10期
关键词:药灸天枢电针

曾于恒 林丽珠 吴小云 吴 锋

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)为非特异炎性肠病,以腹泻、便次增多、黏液脓血便等为主要症状。至目前为止,其病因和发病机理尚未完全阐明[1],由于其病变范围能累及全部肠黏膜,并且病情易反复,迁延难愈,世界卫生组织将其归为难治性疾病,一般认为胃肠道免疫功能的紊乱是其主要病因[2]。流行病学调查[3]显示,近年来该病在亚洲的发病率明显升高。相关研究[4]表明,TGF-β为多效性细胞因子,具有抗炎活性,TGF-β 的活化与受体结合,TGF-β/Smad7信号通过通路调节黏膜免疫作用,促使组织的修复,是治疗UC 的关键靶标。多项研究表明[5-8],针灸能有效治疗UC,本研究通过观察针灸对UC 的疗效,并从黏膜组织基于TGF-β/Smad信号通路方面研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组斯莱克景达公司(湖南省长沙市)提供的40 只SPF 级SD 雄性大鼠(体重:180~200 g),质量合格证号为43004700032111,许可证号为SCXK(湘)2014-0002。动物饲养于该公司SPF 级实验室,温度为20~26 ℃,相对湿度为40%~70%,适应性饲养1 w后,按随机分组法,将其分成空白组、模型组、电针组、隔药灸组各10只。

1.2 实验用药及器材TNBS(SLBG2766W);乙醇(国药集团,批号:20181017);水合氯醛(国药集团,批号:20200917);石蜡切片机(KW2148,浙江温州);显微镜(奥林巴斯BF52);实时荧光定量PCR仪(艾华德replex3);PCR 扩增仪(Bio-RadT110 thermal cycler);化学发光凝胶成像(Bio-Rad);台式高速冷冻离心机(HERNLEZ33HK);核酸水平电泳仪(武汉百达生物BGSUHWIDI);核酸蛋白浓度测定仪(BioDropBD1106);Elisa 试剂盒(重庆基因美生物,批号:E-EL-R0016c、E-AB-16094、E-AB-12904)。

1.3 模型制备禁食、不禁水2 d,空白组予0.6 mL生理盐水灌肠;其余三组于腹腔用10%的水合氯醛350 mg/kg 进行注射麻醉,用灌胃针取0.6 mLTNBS-50%乙醇造模剂注入肛门8 cm。灌肠后提尾倒置30 s,然后归笼,取头低脚高位。模型制备后第2 d,每组随机选取3 只大鼠,观察耸毛、拱背、进食和活动等情况,并处死大鼠取结肠组织,观察结肠病理变化来判定UC模型是否成功[9]。

1.4 干预方法空白组、模型组:无干预。

电针组:造模成功后,将大鼠固定在特制的鼠架上,暴露腹部,根据《实验针灸学》[10]选取天枢(双侧)、气海等穴位(见图1),天枢穴予毫针刺入13 mm,气海穴予毫针刺入7~10 mm,接G6805ll 型电针仪,选择疏密波,20 min/次,每日1次,共14 d。

图1 大鼠气海、天枢(双侧)解剖示意图

隔药灸组:造模成功后,将肉桂5 g、附子5 g 研末,用黄酒混合调制,并用模具做成厚度约0.2 cm、直径约1 cm的药饼,中间用针刺小孔,将药饼置于大鼠的气海穴、天枢穴(双侧),并选择清艾条内的艾绒制成重约1 g、底面直径约1 cm 的圆锥形艾炷,隔药饼灸,每次灸1壮,每日1次,共14 d。

1.5 标本采集干预结束后禁食、不禁水1d,麻醉后解剖腹主动脉,抽取动脉血5 mL,用于ELISA 检测;取3 cm结肠,剖开,分成2段,1段用于RT-PCR检测,1段用于HE染色。

1.6 观察指标

1.6.1 一般情况 整个实验过程,每日观察并记录大鼠精神、活动、体重、饮食、毛色、排便等情况。

1.6.2 大鼠疾病活动性指数(DAI)评分 参考Mur⁃thy 标准[11],DAI 评分为干预后大鼠体重下降率、大便性状、便血程度这3个指标评分的均值。见表1。

表1 大鼠疾病活动性指数(DAI)评分细则

1.6.3 结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分 根据结肠黏膜的病理改变情况来进行评分。0分为结肠黏膜无损伤;1 分为结肠黏膜轻度水肿,无溃疡;2 分为结肠黏膜充血且粗糙呈颗粒状;3 分为结肠黏膜形成<1 cm的溃疡;4分为结肠黏膜溃疡1~2 cm,但和外周脏器没有粘连;5分为结肠黏膜溃疡1~2 cm,肠管增厚,且肠管和周围脏器粘连严重。

1.6.4 病理学观察 取各组大鼠结肠组织,经石蜡包埋切片后进行苏木素-伊红(HE)染色,结肠组织通过显微镜下观察病理学改变。

1.6.5 血清TGF-β、Smad7及IL-10表达量 将结肠黏膜置于玻璃匀浆器中,加入PBS 匀浆,离心15 min,取上清液,采用ELISA法,检测各孔的吸光度值,计算TGF-β、Smad7及IL-10表达量。

1.6.6 结肠组织 TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表达量 采用RT-PCR 法检测。步骤:取100 mg 组织于EP 管,加1 mL Trizol 匀浆、200 μL 三氯甲烷,离心,取500 μL上清液于新EP管,加500 μL异丙醇,离心15 min,弃上清液,取RNA 沉淀干燥至透明状,加150 μL RNase,溶解,混匀,取2 μL用于测定RNA浓度、质量。当OD260/OD280为1.8~2.0时质量较好,取2 μL 进行逆转录,合成cDNA,用Realtime PCR 检测。PCR 扩增:95 ℃预变性2 min;95 ℃15 s,60 ℃1 min,40 次循环,凝胶成像仪检测质量。用2-△△Ct方法计算TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表达量。基因TGF-β、Smad7、IL-10 的引物序列见表2。

表2 基因TGF-β、Smad7、IL-10引物序列

1.7 数据统计方法采用SPSS 20.0 进行统计,各组数据均以()表示,多组间数据经方差齐性检验后,采用单因素方差分析进行两组间比较,检验水平α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

造模后,空白组大鼠神情自然,灵活度好,肛周毛发干净,进食、二便无异常;各模型组大鼠都有耸毛、拱背、进食减少、活动减少甚至不动,伴有稀便。结合病理结果,判定UC造模成功[9]。

2.1 各组大鼠DAI及CMDI评分比较空白组大鼠

DAI、CMDI评分显著低于其他三组(P<0.05);电针组、隔药灸组大鼠DAI、CMDI评分均明显低于模型组(P<0.05);电针组、隔药灸大鼠DAI、CMDI评分比较,无统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠DAI、CMDI评分比较(分,)

表3 各组大鼠DAI、CMDI评分比较(分,)

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.2 光镜下各组大鼠的结肠病理组织比较空白组大鼠结肠黏膜结构完整,无炎性细胞浸润、充血;模型组大鼠结肠黏膜结构较模糊,排列紊乱,腺体结构较不完整,大量炎性细胞浸润,并坏死、出血;电针组和隔药灸组大鼠结肠黏膜结构相对较完整,明显黏膜病变减少,腺体排列较连续,少量炎性细胞浸润。见图2。

图2 光镜下各组大鼠的结肠病理组织(10×10)

2.3 各组大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA表达量比较模型组、电针组、隔药灸组大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA 及IL-10 mRNA 表达量显著高于空白组(P<0.05),电针组、隔药灸组低于模型组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠结肠组织TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表达量比较()

表4 各组大鼠结肠组织TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表达量比较()

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.4 各组大鼠血清TGF-β、Smad7 及IL-10 表达量比较与空白组比较,其他三组TGF-β、Smad7及IL-10表达量升高;与模型组比较,电针组、隔药灸组TGFβ、Smad7及IL-10表达量降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠血清TGF-β、Smad7及IL-10表达量比较(-x±s)

3 讨论

根据UC的临床症状及体征,当归属于中医学“泄泻”“久痢”范畴。《证治汇补》曰:“泄者,大便溏薄;泻者,大便直下,略分轻重,总属脾虚。”可见,UC的发病根本乃脾胃虚弱[12-14]。刘欢等[15]认为,脾虚不运贯穿于UC疾病过程的各个阶段。脾胃虚弱最终可发展为脾肾阳虚,导致清阳下陷,从而使魄门失主,泻下无度,发为久泻,正如《景岳全书》所言:“脾弱者,因虚易泻,因泻愈虚,盖关门不固,则气随泻去,气去则阳衰,阳衰则寒从中生……阴寒性降,下必及肾……所以久泻不愈,必自太阴传于少阴而为肠澼。”因此,UC病位在肠,与脾、肾关系密切。综合其病因病机,治疗当以温补脾肾、通调肠腑为法。

天枢穴归足阳明胃经,乃阳明脉气所发之处,且其为大肠经募穴,参考腑病取募的取穴原则,天枢穴不仅可以有效通调大肠腑气、降浊化湿,而且还有益胃健脾、强身止泻作用。《素问·六微旨大论》云:“天枢之上,天气主之;天枢之下,地气主之。”说明此穴为升清降浊的穴位,可通调脏腑。《千金要方》记载:“大便泄数,并灸天枢。”《针灸大全》曰“泄泻不止,里急后重……天枢二穴。”《针灸大成》描述天枢主“主奔豚,泄泻……水痢不止,食不下,水肿腹胀肠鸣……冬月感寒泄痢”。气海穴乃全身气血汇集之所,可生发元气、培元益肾、扶正固本、益气温阳。《千金翼方》曰“水泄痢,灸气海百壮,三报之”“胀满瘕聚滞下疼冷,灸气海百壮”。天枢、气海相配,可以达到温养脾肾、通调气血、调和阴阳之功效。

电针是将电与针两种刺激方式相结合而防治疾病的一种方法,可以代替人做较长时间的持续运针,且能较客观地控制刺激量。相关研究[16]表明,电针具有促进血液新陈代谢、止痛、调理人体生理机能等作用。对于本研究中电针治疗时所选择的疏密波,李晓璐等[17]认为,该波形具有增强人体代谢、促进血液循环、有效改善组织营养、抗炎、消除水肿等功效。

隔药灸是将中药及艾灸的优势高度结合的一种灸法。本研究中,药饼的组成为附子、肉桂,二者皆大热,味辛,归脾、肾经,善补火助阳,相须为用则功效益彰,可健脾温肾以治其本。其中,附子为补助元阳之要药,具有温补肾阳、回阳救逆之功,《本草正义》曰:“附子辛温大热,性善走,故为通行十二经纯阳之要药。”肉桂具有温经通脉、引火归元、补火助阳之功效,乃治疗命门火衰之要药,《本草求真》曰其“大补命门相火,益阳治阴”。该法集穴、药、灸作用于一体,药物、艾灸对穴位可起到双重刺激作用。

本研究结果发现,空白组上皮结肠黏膜完整,未见充血、水肿,具有完整的腺体性结构,未见炎性细胞浸润;而模型组结肠黏膜破损,伴充血,腺体排列紊乱,炎性细胞大量浸润;电针组、隔药灸组上皮结肠黏膜组织损伤有不同程度修复,腺体量增多,排列较整齐,炎性细胞明显下降,表明电针及隔药灸均能促进黏膜修复且有效抑制炎症反应。

相关研究[18]表明,在免疫缺陷、易感性基因及环境等多方面因素综合作用下,人体分泌过多的炎症介质及炎症因子,导致大肠黏膜受损,发为UC。发病时,黏膜通透性升高,肠内物质通过黏膜固有层进入,激活免疫,导致炎症。课题组前期研究发现[19],UC 的发病机制可能与NOXs 信号通路途径有关,大量ROS活化产生,使NLRP3 小体激活,导致促炎因子大量分泌,而电针及隔药灸治疗溃疡性结肠炎可抑制NOXs-ROS-NLRP3 炎症小体信号通路,从而发挥作用。TGF-β因子可有效抑制肠道炎症性反应,诱导免疫耐受性,恢复受损组织,因而可通过TGF-β 信号通路途径来治疗炎症性肠病[20]。在此通路依赖Smad 途径,p-Smad2 与p-Smad3 结合,并与Smad4 产生复合物质,进入细胞核,靶基因进行调节转录[21]。研究显示[22],UC肠内炎症性特征由p-Smad2/3表达量降低和TGF-β信号传导性受损以及Smad7(磷酸化抑制剂)、IL-10 表达升高所引起[23]。本实验发现,模型组大鼠结肠组织TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA及血清中TGF-β、Smad7 及IL-10 的表达量均明显高于空白组,电针及隔药灸干预后,这些指标均较模型组明显降低,表明电针及隔药灸可能通过TGF-β/Smad7信号通路抑制炎症性反应,促进黏膜修复。

综上所述,电针及隔药灸可促使UC 大鼠结肠黏膜损伤修复,抑制炎症性反应,其作用机制可能与TGF-β/Smad7 信号通路有关。电针及隔药灸如何调控TGF-β/Smad7 信号通路发挥其治疗作用有待今后进一步研究。

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