费陈晨 谌 曦 杨 凯 万 磊 范海霞 刘天阳 李 明 刘 磊 葛 瑶 王晴晴 范文杰 周 倩

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种侵犯滑膜、软骨组织的全身性、系统性、自身免疫性疾病，可导致关节畸形[1-3]及心、肺、肾等器官的严重并发症。RA的发病机制较为复杂，涉及多个生物过程，包括炎症因子释放和信号通路的转导等，但针对其机制研究尚不够完善。目前RA常用治疗药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等，但长期应用的不良反应较多，因此中医药在RA治疗中尤为重要。

中医上本病属于“痹证”“尪痹”“历节风”等范畴，其病因不外乎正气亏虚，风寒湿热等外邪侵袭机体，痹阻气血经络，不通则痛[4]。威灵仙可祛风湿、通经络，牛膝可活血化瘀、补益肝肾、强筋骨，两药配伍共奏祛风通络之效，主治风寒湿痹。两药的临床疗效确切，均可抑制炎症因子释放，达到治疗RA 的作用[5-6]，但介于其化学成分复杂及药物间可能会产生相互作用，其靶点乃至作用机制方面的研究受到限制。目前网络药理学在中药研究方面成果显著，通过构建网络图，可预测药物潜在靶点与作用机制。因此，本研究以网络药理学和分子对接技术为基础，探讨威灵仙-牛膝药对有效活性成分、潜在靶点及其治疗RA 的作用机制，为进一步临床试验与治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 相关数据库及平台中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP)（https://old.tcmsp-e.com/）、GeneCards(Version 5.10)(https://www.genecards.org/)、DisGeNET（v 7.0）(https://www.disgenet.org/home/)、Uniprot 通用蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)、网络图像化软件Cytoscape 3.7.1(http://cytoscape.org/)、String在线(Version:11.5)(https://cn.string-db.org/)、AutoDockTools-1.5.7（https://autodock.scripps.edu/）、pymol-2.4.0（Python Extension Packages for Windows-Christoph-Gohlke)、OpenBabel 3.0.0（http://openbabel.org/wiki/Main_Page）

1.2 药物有效成分及作用靶点的筛选以“威灵仙-牛膝”药对为关键词，通过TCMSP 数据库筛选药对活性成分及作用靶点，筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18。

1.3 疾病RA 相关靶点的检索以“rheumatoid arthritis”为关键词，通过GeneCards、DisGeNET 数据库检索疾病相关靶点，将所得数据导入Uniprot 数据库进行基因标准化处理。

1.4 药物-疾病共同靶点预测及网络构建将所得的药物靶点与疾病靶点相匹配，筛选出交集靶点。通过Cytoscape 分析上述所有信息，构建“疾病-药物-有效成分-靶点”网络图并进行网络特征分析。

1.5 PPI 网络构建和相关靶点筛选将疾病与药物的交集靶标基因导入String 数据库，利用Cytoscae 软件进行分析，构建疾病、药物靶标蛋白质相互作用（PPI）网络，预测靶标蛋白相互作用关系。

1.6 GO 分析和KEGG 通路分析利用String 数据库对药物-疾病的共同靶点基因进行GO 功能分析和KEGG 信号通路富集分析，并通过R 语言绘制条形图和气泡图，根据富集因子值分析核心通路富集程度。

1.7 核心有效成分与核心靶点的分子对接将“疾病-药物-有效成分-靶点”网络中的基因靶点Degree进行降序排列，筛选出威灵仙-牛膝药对前5 位有效成分及核心靶点，在RSCB PDB 数据库中选择相应基因靶点蛋白结构并下载，在TCMSP及Pubchem数据库获取有效成分的结构并下载，再用Open Babel转换成相应的文件格式。通过Auto Dock软件将靶点蛋白和小分子配体进行对接处理，Pymol进行数据可视化。

2 结果

2.1 威灵仙-牛膝药对活性成分及靶点的筛选TCMSP 数据库筛选出威灵仙有效成分7 个，其中4 个无对应靶点予以剔除；牛膝有效成分20 个，其中3 个无对应靶点予以剔除。共得到威灵仙-牛膝药对活性成分19 个（见表1，其中β-谷甾醇为两药的共同活性成分），对应靶点94个。

表1 威灵仙-牛膝活性成分

2.2 威灵仙-牛膝药对治疗RA 关键靶点的筛选采用GeneCards、DisGeNET 数据库检索RA相关靶点，uniprot 进行基因标准化，共得到疾病靶点基因5589个，匹配药物靶点与疾病靶点，筛选出交集靶点72个。

2.3 药物-疾病相关靶点的网络构建将所筛选的活性成分及相关靶点导入Cytoscape 软件，构建“疾病-药物-有效成分-靶点”网络图（见图1），并进行网络特征分析。该图共有109 个节点，652 条边。三角形节点代表RA，菱形节点代表威灵仙-牛膝，六边形节点代表有效活性成分，八边形节点代表靶点，边线代表药物、疾病、有效活性成分与靶点之间的相互关联，图形大小与节点数量呈正相关。根据Degree值高低筛选出前10个核心有效成分(见表2)以及前30个靶点基因（见表3）。结果显示，槲皮素、山柰酚、黄芩素、汉黄芩素为节点值较高的活性成分，说明其在治疗RA中发挥至关重要的作用。

表2 威灵仙-牛膝核心有效成分

表3 网络构建中核心靶点基因

图1 “疾病-药物-有效成分-靶点”网络图

2.4 PPI网络构建与分析交集靶标基因导入String数据库，利用Cytoscape 软件构建PPI 网络,并分析结果，预测靶标蛋白相互作用关系。其中包含82 个节点，1974 条边，节点颜色深浅与节点数目呈正相关。使用Cytoscape 软件处理数据（见图2）并根据Degree值高低筛选出前20个核心靶点基因（见表4）。

表4 PPI网络中核心靶点基因

图2 PPI网络互作图

2.5 GO 分析和KEGG 通路分析应用String 数据库将筛选出来的威灵仙-牛膝药对和RA 的共同靶点72 个，进行GO 和KEGG 富集分析，设定标准为P<0.05，共得到生物过程238 条。其中GO 分析得到106条，前20条结果如图3所示，主要涉及DNA 结合转录因子（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、转录协同调节因子（transcription coregulator binding）、泛素样蛋白连接酶（ubiquitin-like protein ligase binding）等过程。KEGG 分析得到132 条，前20 条与RA 密切相关的通路如图4所示，圆点越大颜色越深，提示该通路富集的靶点越多，P值越小，富集的信号通路与RA 相关的主要涉及PI3K-Akt 信号通路（PI3KAkt signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPKsignaling pathway）、p53 通路（p53 signaling pathway）等。

图3 核心靶点的GO分析

图4 核心靶点的KEGG分析

2.6 核心有效成分与核心靶点的分子对接根据“疾病-药物-有效成分-靶点”网络中交集靶点的Degree 值选择威灵仙-牛膝药对核心活性成分槲皮素、山柰酚、黄芩素、汉黄芩素、β-谷甾醇与核心靶点CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA进行分子对接，其中槲皮素、山柰酚与核心靶点CASP3、CCND1 具体对接过程见图5。对接结果说明威灵仙-牛膝中活性成分与RA关键核心靶点基因有着良好的结合作用。

图5 核心有效成分与核心靶点的分子对接

3 讨论

RA以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现，基本病理改变为滑膜炎，血管翳形成，逐渐出现软骨和骨的破坏，造成关节畸形和功能丧失，严重影响患者的生活质量。目前中药治疗RA 取得良好疗效，威灵仙-牛膝则为临床中的典型药对，但是有关其作用机制及靶点的研究尚不清楚。

传统中医药治疗疾病提倡“人体即一个整体”以及“天人合一”，而网络药理学通过构建“药物-靶点-疾病”网络，探索网络各节点生物功能与疾病的互作关系，这与中医的整体观不谋而合。目前网络药理学已成为中医药药理基础与作用机制研究的热门工具，广泛应用于中药活性成分筛选、药物重定位、中药配伍机制探索及中医药多成分、多靶点、多通路的作用机制阐释等。

本研究运用Cytoscape 软件，构建“疾病-药物-有效成分-靶点”网络图，结果显示槲皮素、山柰酚、黄芩素、汉黄芩素为威灵仙-牛膝药对治疗RA的有效活性成分。槲皮素在治疗RA 方面取得了良好的临床疗效[7]，可以抑制滑膜血管翳的形成，抑制中性粒细胞外诱捕网（NETS）的形成，通过抑制NF-κB通路，抑制金属蛋白酶MMP-13的表达，减少IL-6等炎症因子的释放，改善关节肿胀，达到治疗RA 的目的[8]。山柰酚可通过下调miR-146a，沉默Decorin，使PI3K/AKT/mTOR 通路处于过表达状态，从而达到抗骨关节炎的作用，其还可通过抑制脂多糖（LPS），降低Caspase-1和Caspase-3 的活化水平，减少促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α 的释放，从而减轻炎症损伤[9]。黄芩素对胶原诱导型关节炎小鼠（CIA）有一定治疗作用，可以减轻滑膜增生、延缓骨质破坏和降低外周血中炎症因子释放[10]。汉黄芩素可抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）的增殖并诱导其凋亡，通过下调促炎因子IL-6，降低VEGF 的表达水平，抑制血管翳的形成，减轻关节破坏[11]。

PPI 网络分析结果显示，前十位的核心靶点基因为CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA、MYC、IL-6、EGF、ESR1、PPARG。目前研究发现，Caspase3抑制剂可阻断TNF诱导的单核细胞和巨噬细胞的焦亡，有效缓解CIA 小鼠模型的关节炎[12]。上调lncRNA GAS5，可抑制PI3K/AKT信号通路的活化水平，增强caspase-3、caspase-9 的表达，抑制RA-FLS 的增殖，减轻关节炎症[13]。TP53除了是一种肿瘤抑制因子外，还是一种炎症抑制因子，涉及多个细胞生物过程，与自身免疫性疾病密切相关。MDM2为TP53的关键调控因子，在RA-FLS 中高表达，可通过MAPK 和NF-κB 信号通路影响TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，调节炎症状态，其抑制剂具有抗炎活性，可能成为治疗RA 的新靶点[14]。CCND1的过表达可以抑制软骨细胞自噬，促进骨关节炎中的软骨细胞增殖，主要作用机制包括SN⁃HG16调控的microRNA-93-5p/CCND1 轴[15]、cir⁃cRHOT1 调控的miR-142-5p/CCND1 轴[16]等。目前研究发现，MDM2del1518 变异与RA 之间存在相关关系[17]。HIF1A 是一种缺氧诱导因子，主要依赖的糖酵解途径协调TH17和Treg细胞分化，HIF1A的缺失，可下调TH17，上调Treg，保护小鼠免受自身免疫性神经炎症[18]。VEGF 的表达主要受相关转录因子、炎症因子等的影响，通过降低IL-1β、IL-6及TNF-α的水平，可抑制VEGF 的过表达，抑制滑膜血管翳的形成，治疗RA[19]。研究发现，VEGE 的水平与RA 发病密切相关，可作为评估RA疾病活动新标志物[20]。IL-6在RA的发病中发挥着至关重要的作用，使成骨与破骨细胞之间的平衡失调，诱发骨质疏松[21]。靶向IL-6慢病毒介导RNA 干扰的体外、体内试验，在CIA 模型中取得良好疗效，可作为RA的新型靶向基因治疗[22]。

GO和KEGG富集分析结果显示，威灵仙-牛膝药对通过DNA 结合转录因子、RNA 聚合酶II 特异性DNA结合转录因子、转录协同调节因子等实现分子功能，其作用信号通路与PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路及p53 信号通路最为相关。其中，PI3K/Akt 信号通路通过刺激促炎因子释放，诱发细胞凋亡失衡，使RA-FLS 出现异常增殖[23]，研究表明其对滑膜炎症以及骨破坏也有一定的影响[24]。p38 MAPKs信号通路与RA 滑膜细胞密切相关，其抑制剂能够通过抑制IL-1、IL-6 及TNF-α 等促炎因子的释放[25]。MiR-143-3p 抑制剂能降低Ras、p-p38 的表达，抑制Rasp38 MAPKs 通路的活化水平[26]。研究发现，Triad1 可能通过p53信号通路诱发RA-FLS的凋亡[27]。

采用分子对接技术将威灵仙-牛膝药对活性成分槲皮素、山柰酚、黄芩素、汉黄芩素、β-谷甾醇与核心靶点蛋白CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA 进行结合能力预测，结果显示槲皮素、山柰酚等成分与CASP3、CCND1 等核心靶点蛋白有较强的结合能力，说明威灵仙-牛膝药对RA有一定的治疗作用。

因此，可以推断威灵仙-牛膝可以通过槲皮素、山柰酚、黄芩素、汉黄芩素等活性成分，调节CASP 3、TP 53、CCND 1、HIF1A、VEGFA、IL-6 等靶点基因表达，影响PI3K-Akt、MAPK 及p 53 信号通路等的活化水平，抑制促炎因子的释放，改善滑膜炎症与骨破坏，从而发挥治疗RA的作用。

本研究以网络药理学和分子对接技术为基础，阐明了威灵仙-牛膝药对通过多成分、多靶点、多通路治疗RA 的作用机制，为进一步临床试验及治疗提供新思路，但其结果的准确性还有待于体内、外试验的验证。