酱卤肉制品是我国典型的传统熟肉制品，是将牛肉、鸡肉、鸭肉等畜禽肉及其可食副产品放入调制好的卤水中烧煮而成的。因产品口感酥软、风味浓郁，食用后唇齿留香、回味无穷，而深受消费者喜爱，各式各样的卤肉制品在市场、超市、小卖部等商铺皆占有一席之地。一些商家为吸引顾客、增大销量，在卤制过程中添加违禁染料以增加产品色泽，让食物看起来香艳可口，引起消费者的购买欲望。其中，酸性橙Ⅱ因其色泽鲜艳、着色稳定和价格低廉，极大可能被添加到产品中增色。酸性橙Ⅱ是一类偶氮染料，具有致癌作用，长期接触这类染料会给身体健康带来严重威胁。在2008年原卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》中指明，严禁将酸性橙Ⅱ作为着色剂用于卤制熟肉制品[1]。

目前酸性橙Ⅱ的检测方法有薄层色谱法[2]、酶联免疫法[3]、高效液相色谱法[4-6]和液相串联质谱法[7-8]。主要用到的前处理方式有固相小柱净化[9-11]，分子印迹微萃取[12]、液液萃取[13]和基质分散萃取[14-15]等。根据国家监督抽检细则，卤肉制品中酸性橙Ⅱ的检测按照SN/T 3536—2013标准进行，标准使用的方法是高效液相色谱法。本文将采用固相萃取柱净化，优化前处理条件，高效液相色谱法测定酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ的含量，建立简便、高效、重现性好的检测方法，为检验部门提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（Thermo U3000）、氮吹仪（Evatros TCS）、振荡仪（IKA）、超声仪（Branson）、离心机（SIGMA）、涡旋振荡器（IKA）、旋转蒸发仪（RV 10 Auto）、pH计（梅特勒）、水浴锅（HH-4）、超纯水机（默克）。

氨水（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、柠檬酸（分析纯）、超纯水（18.2 MΩ·cm）和石油醚（分析纯）；酸性橙Ⅱ标准品：Bepure，250 mg，96.5%；固相萃取柱：氨基阴离子交换柱（Welchrom NH2，500 mg/6 mL）、聚酰胺柱（Cleanert JXA，500 mg/6 mL）、弱阴离子交换柱（Cleanert PWAX，500 mg/6 mL）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

准确称取0.010 00 g标准品于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀得浓度为1 000 μg·mL-1的一级标准储备液。准确移取1.00 mL的一级标准储备液于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀得浓度为100 μg·mL-1的标准工作溶液。

1.2.2 试剂配制

1%氨水乙醇：1 mL氨水和70 mL无水乙醇混匀，用水定容至100 mL；5%氨水乙醇：5 mL氨水和70 mL无水乙醇混匀，用水定容至100 mL；10%氨水乙醇：10 mL氨水与70 mL无水乙醇混匀，用水定容至100 mL；20%氨水乙醇：20 mL氨水与70 mL无水乙醇混匀，用水定容至100 mL；5%氨水甲醇：5 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混匀；10%氨水甲醇：10 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混匀；15%氨水甲醇：15 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混匀；20%氨水甲醇：20 mL氨水用甲醇定容至100 mL，混匀；20%柠檬酸溶液：称取20 g柠檬酸用水定容至100 mL，混匀；2%甲酸水：移取2 mL甲酸用水定容至100 mL，混匀；0.02 mol·L-1乙酸铵溶液：称取1.54 g乙酸铵用水定容至1 000 mL。

1.2.3 样品前处理

（1）样品预处理：按照四分法取样，打碎磨细，-20 ℃保存，称样前需恢复至室温。

（2）称取2 g（精确至0.001 g）样品，加入10 mL 20%氨水-70%乙醇水，超声10 min，振荡10 min，8 000 r·min-14 ℃离心5 min，取出上清液，重复提取一次，合并提取液，70 ℃氮吹至5 mL左右，用20%柠檬酸调pH为8，8 000 r·min-14 ℃离心5 min，待净化。

（3）PWAX柱依次用3 mL甲醇和3 mL 2%甲酸水活化，取全部上述样液过柱后，依次用3 mL 2%甲酸水、3 mL甲醇淋洗，柱抽干后，用9 mL 15%氨水甲醇分3次洗脱，收集洗脱液，50 ℃氮吹干，加入2 mL水复溶，0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.2.4 液相色谱仪条件

色谱柱：C18柱Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；波长：484 nm；流速：1 mL·min-1；流动相比例：甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸铵溶液=65∶35；进样时间：15 min。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的选择

分别采取4种不同比例的氨水乙醇水溶液对酸性橙Ⅱ加标样品进行超声、振荡提取，50 ℃氮吹蒸干后复溶、过膜上机。上机结果显示1%氨水乙醇水、5%氨水乙醇水、10%氨水乙醇水提取回收率在70%～80%，而20%氨水乙醇水提取回收率在90%以上，实验表明20%氨水乙醇水的提取效果最佳，因此选择20%氨水乙醇水为提取试剂。由于酱卤肉制品蛋白质、脂肪含量高，提取前应先加入适量石油醚除脂，并于通风橱中挥干再加入提取试剂，提取后选择低温离心以沉淀蛋白质，保证上样样液澄清，防止过柱时造成固相萃取柱堵塞。

2.2 浓缩方式的选择

在提取试剂中加入标液混匀后分别选择水浴、氮吹、旋蒸方式浓缩，其中分为60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴浓缩，50 ℃、60 ℃、70 ℃氮吹浓缩，常温、30 ℃、40 ℃旋蒸浓缩。实验发现，60 ℃、80 ℃水浴浓缩耗时长，回收率在50%～60%，100 ℃水浴浓缩虽然速度快但回收率只有30%；50 ℃、60 ℃氮吹耗时较长，70 ℃氮吹耗时相对较短，且3个温度下回收率皆在90%以上；常温、30 ℃旋蒸时间长，40 ℃旋蒸容易爆沸，加压后冲上连接管，使样液损失，而样液流回鸡心瓶会造成样品间污染，不适用于该样液浓缩。因此，选择70 ℃氮吹为提取液浓缩方式。

2.3 固相萃取柱的选择

固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是目标物通过在吸附剂填料中选择性保留与选择性洗脱从而实现净化的一种分离技术。实验研究加标样液在相同条件下分别使用氨基阴离子交换柱（NH2）、聚酰胺柱（JXA）、弱阴离子交换柱（PWAX）3种固相小柱进行净化，浓缩后复溶上机。结果显示使用氨基阴离子交换柱的回收率在20%～40%，使用聚酰胺柱的回收率在30%左右，而使用弱阴离子交换柱的回收率可达60%以上。为了进一步分析各小柱净化过程中对目标化合物的保留、洗脱效果，分别收集过柱后样液、淋洗液、洗脱液浓缩后上机，上机浓度结果见表1。

表1 溶液中酸性橙Ⅱ上机浓度结果表

分析表1实验结果可知，氨基阴离子交换柱对上样样液保留效果差，聚酰胺柱上样后使用2%甲酸水淋洗会造成损失，而过弱阴离子交换柱后的样液、淋洗液中均未检出目标物，说明该柱对目标物的选择性高、保留效果好，因此实验选择PWAX柱作为酸性橙Ⅱ的净化柱。

2.4 pH对固相萃取柱吸附与洗脱的影响

PWAX是一种聚合物基质吸附剂，虽然pH适用范围广（0～14），但针对特定目标物也有最适pH值，需研究上样样液pH对PWAX柱保留性及后续洗脱效果的影响。将上样样液分别调pH至2、4、6、8，上样后，收集过柱后样液、淋洗液，吹干后复溶上机，结果均未检出目标物，表明PWAX的吸附能力受pH影响小。进一步分析洗脱液用量对洗脱效果的影响，上样后先后使用2%甲酸水和甲醇淋洗，同时收集淋洗液，氮吹干复溶上机，结果显示未出峰，说明淋洗不会造成损失。对上述采用4种不同pH上样样液的固相萃取柱分别用10%氨水甲醇进行多次洗脱，并分别收集每次洗脱液，氮吹干复溶上机，上机浓度结果见表2。

表2 各洗脱液中酸性橙Ⅱ上机浓度结果表

分析表2实验结果可知，当上样样液pH=2、pH=6、pH=8时，相同碱性的洗脱液用量相同（10 mL）的情况下，目标化合物回收率均在70%以上，考虑到上样前调pH至2、6时柠檬酸溶液用量大，上样量增多，上样时间增加，为节省实验时间，提高效率，上样前调pH至8较为合适。

2.5 洗脱液的选择

弱阴离子交换柱，洗脱液通常选用氨水甲醇进行洗脱。为达到更好的洗脱效果，本研究采取4种浓度的氨水甲醇对固相萃取柱进行洗脱，结果表明5%氨水甲醇、20%氨水甲醇洗脱效果一般，而10%氨水甲醇、15%氨水甲醇洗脱效果均较好，回收可达到80%以上，但10%氨水甲醇需20 mL才能将目标物全部洗脱下来，而15%氨水甲醇只需9 mL即可将目标物全部洗脱，相对于10%氨水甲醇用量大大减少。因此，采用15%氨水甲醇作为固相萃取柱的洗脱液。研究发现少量多次洗脱比单次大量洗脱效果更好，所以实验采用9 mL 15%氨水甲醇分3次洗脱，且每次洗脱后都要抽干小柱。

2.6 线性范围及检出限

分别准确吸取适量酸性橙Ⅱ标准储备液（100 μg·mL-1），用水稀释配制成浓度为 0.1 µg·mL-1、0.2 µg·mL-1、0.5 µg·mL-1、1.0 µg·mL-1、2.0 µg·mL-1、5.0 µg·mL-1和 10.0 µg·mL-1的标准工作液，按照设定的液相仪器参数进样，以酸性橙Ⅱ色谱峰面积（y）对酸性橙Ⅱ质量浓度（x）作标准曲线，得酸性橙Ⅱ的线性方程为y=0.358 3x，相关系数R2为0.999 9。结果表明，酸性橙Ⅱ在0.1～10.0 μg·mL-1线性良好。以3倍信噪比为检出限（Limits Of Detection，LOD），当取样量为2 g时，酸性橙Ⅱ的方法检出限为0.1 mg·kg-1，满足检测的要求。

2.7 回收率及精密度

为验证方法的可行性，称取2 g阴性样品，分别添加 0.1 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1和 1.0 mg·kg-13 个浓度水平，每个水平做6个平行实验，结果见表3。酸性橙Ⅱ在3个添加水平的回收率在80.0%～97.5%，相对标准偏差（RSD）小于5%（n=6）。实验结果表明该方法具有较好的回收率与精密度，满足酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ测定的要求。

表3 酸性橙Ⅱ加标回收率和精密度（n=6）结果表

2.8 实际样品测定

对东莞市监督抽取的30份各类酱卤肉制品（包括酱牛肉、卤鸡翅、卤鸭脚等）进行检测，均未检出阳性样品。虽然暂未检出阳性样品，但食品安全问题不容忽视，食品监管部门仍需加强抽检。

3 结论

本研究建立了固相萃取净化、高效液相色谱测定酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ含量的方法。研究发现若在样品提取前先加入石油醚除去油脂，过柱前先采用低温高速离心沉淀蛋白质，可以得到较澄清的上样液，过固相萃取柱时，不会堵塞填料，从而提高净化效率。经过旋蒸、水浴两种浓缩方式实验对比，发现70 ℃氮吹浓缩可同时处理大批量样品，减少交叉污染，降低目标物损失，可保证整个实验的高效性与准确性。研究采用弱阴离子交换柱对样液进行净化，可大大提高对酸性橙Ⅱ的吸附保留作用，增大洗脱液碱性与少量多次洗脱，不仅减少试剂使用量、缩短洗脱时间还能保证洗脱效果。研究通过优化前处理条件，缩短实验时间，减少试剂使用量，而提高检验工作效率。本方法便捷、高效、节能，为食品检测部门测定酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ的含量提供参考。