李志超李念虎薛海鹏陈仁场高 尚

(1.山东中医药大学第一临床医学院,济南 250014;2.山东中医药大学附属医院,济南 250014)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)通常会导致大范围的感觉运动神经和自主神经损伤。据美国SCI统计中心统计,仅美国每年新增病例约17000例,治疗的年平均费用高达676000美元,是世界范围内一个严重的公共卫生问题[1]。SCI的病理过程包括最初的机械性损伤和随后的继发性损伤,继发性损伤期会持续加重SCI程度,因此该阶段也是SCI治疗的关键时期。考虑到神经元细胞死亡作为此时期关键的病变机制,是造成神经功能障碍的主要原因,而自噬性细胞死亡为神经细胞死亡的主要方式之一,所以深入研究涉及细胞自噬的调节机制对开发新的有效治疗方法至关重要[2]。信号通路即细胞信号的传导途径,在SCI病程中,多种因素可通过相关信号通路来影响自噬,而合理调节自噬被认为会对受损神经组织起到重要保护作用[3]。基于此,本文对自噬与SCI的联系以及自噬相关信号通路调控自噬流干预SCI的作用机制进行综述,以期为SCI的治疗寻找新的突破口。

1 细胞自噬在脊髓损伤中的作用

自噬是一个重要的细胞内降解过程,自噬体将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和细胞内的病原体包裹,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,将包裹的内容物降解回收并重新用于细胞能量和功能,这一动态循环过程被称为自噬流,在维持细胞内稳态中发挥重要作用。自噬标志物微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3)、beclin-1蛋白及p62蛋白反映了自噬流的水平。在自噬过程中,LC3从其胞质形式 (LC3Ⅰ)转化为LC3Ⅱ形式,参与自噬体膜的形成;beclin-1则被Unc-51样自噬激活激酶-1(ULK1)磷酸化,作为磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)复合物的整体支架,促进自噬蛋白定位到自噬泡;自噬适配器sequestosome-1(p62)作为自噬降解底物的受体,一同在自噬溶酶体内降解。LC3Ⅱ、beclin-1水平升高及p62水平降低,表示自噬流被激活,相反则表示自噬流受阻[4]。在SCI发生后,由于受损的细胞器和蛋白在神经元中不断积累,因此许多学者认为激活自噬将有利于SCI继发性损伤期的恢复[5]。然而,自噬不仅参与细胞合成和降解之间的平衡,在部分研究中,激活的自噬不仅没有起到细胞保护作用,反而可能因过度激活自噬导致过度自我消化从而造成细胞程序性死亡,即自噬性细胞死亡[6]。因此探究SCI后神经细胞自噬机制,有效利用自噬规律,从而合理调节自噬流,将成为SCI研究的重点方向。目前,基于各种自噬相关信号通路的研究正在试图阐述激活或抑制自噬对SCI恢复造成的影响,但结果往往存在争议,可能与SCI的位置和程度、激活自噬的程度、急性还是慢性的操控、持续时间、是否只是单独激活自噬等因素相关[7]。但不可否认的是,通过某些自噬相关的信号通路调节自噬流,确可起到对损伤神经的保护作用,改善损伤后的脊髓功能。

2 各信号通路在脊髓损伤自噬中的联系

2.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路

PI3K/Akt/mTOR信号通路被认为是SCI中参与自噬的核心信号通路[8]。PI3K分为3种亚型,即Ⅰ～Ⅲ型。PI3K-Ⅰ型由调节亚基p85和催化亚基p110构成二聚体,受各种生长因子和相关受体蛋白的配体所激活。PI3K催化磷脂酰肌醇二磷酸生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),PIP3与含有PH结构域的蛋白Akt和PDK1结合,调节PDK1以激活Akt。活化的Akt则会进一步激活下游的靶蛋白mTOR。mTOR由两个不同核心蛋白质复合物组成,即mTOR复合物1(mTORC1)和mTORC2,mTORC1能被磷酸化的Akt激活。mTORC1的激活将抑制细胞自噬,发挥负向调节自噬过程的作用。

目前,很多研究通过PI3K/Akt/mTOR信号通路双向调节自噬,以达到减少SCI后体内细胞凋亡并诱导运动恢复的目的[9]。相关研究发现,在SCI后第7天应用合适剂量褪黑素(MT)后,SCI大鼠神经元中LC3Ⅱ、beclin-1表达明显升高,p62表达明显下降,p-PI3K、p-mTOR和p-Akt表达明显降低,而神经功能改善明显,证明MT通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,增强神经元自噬并抑制细胞凋亡,进而改善运动功能障碍[10]。Wang等[11]研究发现,在机械损伤的脊髓神经元中自噬的发生要早于细胞凋亡,并且经PI3K特异性抑制剂LY294002处理后,Akt和mTOR磷酸化水平降低,LC3Ⅱ表达升高,证明SCI后自噬水平与PI3K/Akt/mTOR信号通路活性呈负相关,支持通过抑制该通路适度增加自噬从而发挥治疗作用。也有研究通过激活该通路抑制过度自噬来促进SCI的恢复。Zhang等[12]发现碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)通过抑制过度自噬来保护运动神经元的存活并改善SCI的恢复,其作用机制与BFGF通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制过度自噬和增强泛素化蛋白清除有关。PI3K/Akt/mTOR信号通路介导了疾病发展,因此通过该通路合理调节自噬能明显抑制神经元凋亡,促进细胞存活,从而有效保护神经元,最终能应用于疾病的治疗。

2.2 MAPK/ERK1/2/mTOR信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该通路包含了4条分支路线,即细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和细胞外调节蛋白激酶5(ERK5)。其中,MAPK/ERK1/2/mTOR信号通路在SCI中与自噬的关系讨论相对较多,其余分支路线研究较为匮乏。ERK由ERK1和ERK2组成,可被神经递质、神经营养因子等诱导致磷酸化而被激活,活化后的ERK1/2激活下游靶蛋白,参与调控细胞的自噬、凋亡、增殖、分化等重要的细胞过程。

MAPK信号通路在SCI的发展进程中扮演着重要角色。据报道,在SCI发生后观察到MAPK/ERK信号通路激活明显增强,而MAPK的特异性抑制剂PD98059减轻了SCI相关的炎症和组织损伤的发展程度[13]。虽然近年来有关MAPK信号通路如何调控自噬一直受到人们的关注,但由于其参与调控SCI中自噬的机制极其复杂,所以目前的研究似乎还存在相互矛盾的情况。例如,Tang等[14]用双过氧钒(bpV[pic])处理大鼠SCI模型中发现ERK1/2磷酸化水平升高,细胞自噬增强,而在使用ERK1/2抑制剂SCH772984后,bpV(pic)引起的自噬增加被逆转,证明了bpV(pic)通过激活ERK1/2信号促进自噬,抑制细胞凋亡,从而减少神经元丢失。而Zhu等[15]在有关雷公藤甲素(TP)干预SCI的研究中发现ERK1/2的磷酸化水平降低,细胞自噬增强,神经元细胞死亡减少,表明TP通过抑制ERK1/2信号通路增强自噬发挥其在SCI中的保护作用。产生矛盾的研究不仅仅存在上述文献中。SOX2是SOX基因家族的“创始成员”之一,可抑制MAPK通路的激活。Li等[16]发现在SCI大鼠中给予miR-103模拟物上调了SOX2的表达,降低了p-ERK和p-MAPK的表达,有趣的是,该研究同时表明miR-103过度表达降低了细胞自噬水平,起到了对SCI的保护作用。可以看出,通过该通路抑制还是增强自噬对SCI起到保护作用存在疑惑,且近年来的研究也发现无论是激活还是抑制该通路均可诱导自噬的发生,但其具体机制不详。因此,MAPK信号通路在SCI中诱导细胞自噬作用的精细分子机制,值得更深入的研究。

2.3 AMPK信号通路

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)由α、β、γ 3种亚基构成三聚体,其活性主要受细胞内AMP/ATP的比值影响,当机体处于能量匮乏状态时,AMP/ATP比值升高激活肝激酶B1,磷酸化α亚基导致AMPK表达的上调,AMPK的上调可通过两种方式:磷酸化结节硬化复合物(TSC2)或直接通过Raptor,以抑制下游信号因子mTORC1的活性,从而参与自噬的调控[17]。并且,AMPK上游信号因子ULK1、p53和下游信号因子p27kip1也均能参与自噬的诱导,这提示我们深入研究AMPK相关信号通路,有助于我们理解SCI中自噬的具体机制。

围绕AMPK/mTOR通路,大量研究证明了其对SCI存在影响。研究显示,在SCI后AMPK磷酸化显著增强,mTOR磷酸化明显降低,表明AMPK/mTOR信号通路被激活[18]。SCI大鼠模型经二甲双胍治疗后功能改善,LC3、beclin-1表达增加,同时检测到AMPK的激活及其下游mTOR信号的抑制,提示AMPK信号通路参与了二甲双胍调节自噬流的过程[19]。类似的实验结果也出现在锌[20]、白藜芦醇[21]等药物的研究中。转录因子EB(TFEB)在以往的研究中被认为是参与自噬调控的中枢因子,并参与调控溶酶体的合成[22]。TFEB会被各种细胞应激所激活,触发AMPK的磷酸化,伴随AMPK/mTOR的激活,mTORC1的失活不再磷酸化TFEB[23],使TFEB的核转位得以实现。神经突起导向因子-1(netrin-1)因在胚胎及神经系统发育中发挥轴突导向功能而备受关注[24]。最新研究发现[25],netrin-1可通过AMPK/mTOR/TFEB通路调节大鼠SCI后TFEB的磷酸化状态,从而促进溶酶体的生物发生,有利于自噬小体的降解,激活自噬流,达到抑制神经元凋亡、促进功能恢复的目的。桦木酸被证明同样通过AMPK/mTOR/TFEB信号通路,增强了SCI中的自噬,增加的自噬又诱导线粒体自噬,减少ROS积累,抑制焦亡,有利于SCI的治疗[26],这提示我们通过AMPK/mTOR/TFEB信号通路调控TFEB的核定位来调控溶酶体的发生发展可能是一种潜在的治疗SCI的策略。

2.4 NF-κB信号通路

核因子κB(NF-κB)家族有5个成员,包括p50、p52、p65、Rel-B和c-Rel。NF-κB蛋白由p65和p50亚单位构成二聚体,并与抑制蛋白IκB结合构成三聚体复合物而处于失活状态。IκB蛋白家族则包括IκBα、β、γ、ε、p100、p105等诸多成员。该通路的激活常见于典型途径和替代性途径:典型途径由促炎细胞因子等触发,而替代性途径由IKKa诱导p100磷酸化,导致Rel-B/p52异二聚体激活,这些途径的特点是对IKK亚单位的不同需求,IKK复合物由两个激酶亚基(IKKα和IKKβ)和一个调节亚基(IKKγ)组成。当刺激因素激活NF-κB后,磷酸化IKKβ亚基,IκB被置换出来并受到蛋白酶体降解,从而活化NF-κB并使其易位进入细胞核,进而参与调整细胞的炎症、自噬、凋亡等功能。

在有关SCI的研究中,基于NF-κB通路探讨自噬的研究尚少,主要是通过与其他通路串扰诱导炎症等反应来探讨与自噬的相互作用机制。炎症反应贯穿于SCI的整个发生发展过程,通过抑制NFκB通路可减轻炎症反应并改善功能恢复[27]。值得注意的是,NF-κB与自噬之间也存在着广泛的联系和复杂的调控机制[28]。这种调控机制通常不是单纯的促进或者抑制,而是表现为双向调节:NF-κB能够诱导自噬相关蛋白的表达来促进自噬的发生;而自噬又能够下调IKK复合体,抑制NF-κB通路[29]。SCI最初(数小时内)的炎症反应会加重中枢神经系统后期的损伤,而快速诱导自噬可能有助于维持局部微环境稳态和减轻神经元损伤。Guo等[30]建立小鼠脊髓半切模型后注射粒细胞集落刺激因子(GCSF),发现SCI后自噬被激活,且G-CSF处理组自噬的激活更为迅速,并对NF-κB信号通路产生抑制,认为G-CSF在SCI后的及时使用可通过抑制NF-κB信号通路促进自噬,保护SCI后的神经元结构。另有研究指出[31],ω-3游离脂肪酸通过增强自噬降解炎性复合物从而减轻炎症,也可抑制NF-κB活化来阻止炎症启动,提示NF-κB、自噬与炎症之间存在着潜在的相互联系。然而,在其他很多疾病环境下,NF-κB信号通路对自噬起激活作用[32],也可以起失活作用[33],其介导自噬对机体本身可以是保护机制[34],也可加重疾病的发展[35]。提示NF-κB通路的作用机制仍然存疑,这种差异可能来自于不同的刺激环境、细胞类型和细胞状态。但毫无疑问的是,在SCI中,自噬与炎症存在广泛的交互调控机制,而NF-κB信号通路可认为是构成“脊髓损伤-自噬-炎症”链条的关键通路,值得进一步深入研究。

2.5 其他自噬相关通路

2.5.1 p53信号通路

p53作为自噬调节过程中的关键分子,根据其细胞定位的不同在自噬调节中发挥双重作用。细胞核内的p53促进细胞自噬,而胞浆中的p53发挥着抑制细胞自噬的作用[36]。细胞核中的p53通常通过三方面促进自噬,一是p53通过激活损伤相关自噬调节因子(DRAM)、死亡相关蛋白激酶(DAPK-1)等自噬基因,二是解除mTOR对自噬的抑制作用,三是诱导凋亡调节因子(TIGAR)表达并抑制ROS的产生来激活自噬[37]。而细胞质中的p53则通过抑制AMPK活性或激活mTOR来抑制自噬的发生[38]。大量研究也表明P53信号通路在SCI后发挥着重要的调控作用,可参与调节轴突生长和可塑性、胶质和纤维化瘢痕形成,以及影响运动功能恢复的小胶质细胞/巨噬细胞增殖[39]。进一步将p53信号通路与SCI中自噬的调节联系起来,充分发挥不同阶段p53信号通路对细胞自噬的调节作用进而治疗SCI是十分有必要的。

2.5.2 Keap1/Nrf2/ARE信号通路

核因子E2相关因子2(Nrf2),受Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)的调控,通过与抗氧化反应元件(ARE)结合,在细胞内发挥着抗氧化和抗炎的重要作用。研究表明SCI后激活的Nrf2/ARE信号通路可以减少炎性反应并促进神经功能恢复[40]。在正常情况下,Keap1将Nrf2收集在细胞质内,严重SCI后自噬流的阻断导致自噬相关底物p62的蓄积,过多的p62通过将Nrf2和Keap1置换出来与Keap1结合[41],被置换出的Nrf2进入细胞核中激活多种抗氧化基因和NF-κB等的转录,抑制氧化应激相关蛋白的表达[42],减少损伤后的炎性反应,改善SCI后运动神经元的恢复[43]。抑炎、抗氧化应激、促自噬等作用表明该通路是治疗SCI的有效潜在靶点。

2.5.3 BDNF/TrkB信号通路

脑源性神经营养因子(BDNF)与酪氨酸激酶受体B(TrKB)结合,通过激活下游多个信号通路参与神经可塑性、细胞存活、轴突生长等多种重要的细胞生命活动[44]。并且,BDNF在调节SCI自噬中具有关键作用,可通过促进自噬来维持神经元存活[45],并且可通过影响PI3K/Akt等自噬相关信号通路来调整自噬,对SCI提供保护性功能[46]。合理调控BDNF/TrkB信号通路从而发挥自噬的保护性功能,对SCI的治疗将有积极作用。

此外,还有部分通路如HIF-1信号通路[47]、Wnt信号通路[48]、Notch信号通路[49]、JAK/STAT信号通路[50]等,最新的研究表明通过影响这些信号通路调节自噬,均对SCI的治疗产生了有益作用。当然,这些通路的研究目前仍处于起步阶段,但治疗潜力毋庸置疑,值得深入研究。

3 结论与展望

自噬水平的调整在治疗SCI中的重要性是毋庸置疑的,自噬流的变化在某种程度上也反映了SCI的病理变化。并且,SCI中自噬在不同损伤程度、刺激因素、时间模式等影响下是具有保护性还是损害性仍有待明确,但似乎越来越多的证据表明,自噬在SCI中的作用主要是有益的。在信号通路调节自噬的研究过程中,不可避免的出现了许多问题:(1)由于不同信号通路存在交联,不同的刺激因素对同一条信号通路也会产生不同的结果,如何选择性的调整某条信号通路对自噬造成影响十分困难;(2)适度的自噬是维持细胞稳态的必要条件,因此如何通过信号通路启动自噬、调整信号通路使得自噬水平处于适度的区间,需要深入研究;(3)许多药物可以激活信号通路来对自噬产生影响,但不同药物、相同药物不同剂量、药物的不同使用时间造成的结果存在差异,这与SCI中自噬的动态变化有关,所以明确研究药物与模型的动态匹配关系十分重要。总之,目前有关SCI的治疗尚无彻底解决之道,但无论自噬还是相关信号通路在SCI中的作用机制研究已经成为一种热潮。深入理解“SCI-信号通路-自噬”的链条关系,通过特异性调节相关信号通路,从而维持自噬流的通畅和合适水平,进而对SCI发挥保护性功能,将为我们治疗SCI提供新的有效靶点。