郝芳 单春光 贾巧静 尹晓妍 岳丽艳

(河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北 石家庄 050004)

喉癌是仅次于肺癌的呼吸系统恶性肿瘤。我国每年新发患者数达2.6万例，死亡患者达1.5万例[1]。以鳞癌最为常见，占所有病理类型的95%以上。其起病隐匿，早期发现困难，而中晚期患者需行全喉切除，远期生存预后较差[2]。目前喉癌发生的分子机制尚不清楚，研究表明喉癌的发生与细胞自噬、免疫微环境功能紊乱等因素有关[3]。神经轴突导向因子(Semaphorin 3F，SEMA3F)基因位于人类3号染色体，编码蛋白属于Semaphorin家族成员，该家族的分泌信号蛋白参与神经元发育过程中的轴突引导[4]。研究发现，SEMA3F能以自分泌方式起作用来诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和存活，并作为抗肿瘤的抑癌基因[5]。神经菌毛蛋白2(Neuropilin 2，NRP2)的编码基因位于2q33.3，该基因编码蛋白属于神经纤毛蛋白家族的一个成员，能与血管内皮生长因子(VEGF) 相互作用，在心血管发育、轴突引导和肿瘤发生中发挥作用[6]。研究发现，NRP2在膀胱癌、肺癌等多种恶性肿瘤中表达升高，其过表达通过促进肿瘤细胞的恶性增殖及上皮间质转化，导致肿瘤的恶性进展[7-8]。本研究通过研究喉癌中SEMA3F、NRP2的表达，探讨SEMA3F、NRP2在喉癌中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月～2018年3月我院收治的82例喉癌患者为研究对象。纳入标准：①经病理HE染色，两位病理科医师明确诊断为喉鳞状细胞癌。②首次诊治，于我院完成常规标准治疗。③临床资料完整，患者能配合检查随访。④患者及家属知情并签署知情同意书。排除标准：①获取病理标本前未接受放化疗治疗。②伴精神障碍性疾病等。③伴严重的脏器功能障碍。患者中男性68例，女性14例；年龄30～76岁，平均(56.3±6.2)岁；声门型44例，声门上型25例，声门下型13例；肿瘤TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期37例；高分化50例，中低分化32例；伴淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者46例。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 应用荧光定量PCR检测组织中SEMA3F、NRP2的表达 液氮中将癌及癌旁组织研磨，EP管中离心去除下层沉淀。应用天根RNA提取试剂盒(北京天根，DP430)提取组织中总RNA，Nanodrop1000检测RNA的浓度。应用反转录试剂盒逆转录合成cDNA(北京天根，RP1105)。以cDNA为模板，进行荧光定量PCR反应。总体系20 μL，包含SYBR Green Premix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6 μL。反应条件为：95℃ 4 min，95℃ 30 s，58℃ 25 s，70℃ 30 s，共40个循环。SEMA3F、NRP2的表达以2-ΔΔCt值表示。根据组织中SEMA3F、NRP2 mRNA表达的平均数为界，分为高表达组和低表达组。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 资料收集及观察指标 ①收集所有研究对象性别、年龄等一般临床资料。②收集肿瘤分型、肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移等临床病理资料。③收集患者随访过程中生存状态，生存状态使用3年总体生存(Overal survival,OS)来评价,3年OS定义为从首次确诊之日开始至无论何种原因导致的死亡或者末次随访的时间。

1.2.3 出院随访 出院后开始随访，以电话方式每三月随访一次，随访内容为患者生存状态。随访三年，随访终止日期2021年3月。

2 结果

2.1 喉癌中SEMA3F、NRP2表达 癌及癌旁组织中SEMA3F mRNA的相对表达量分别为0.810±0.132、3.415±0.826，NRP2 mRNA的相对表达量分别为4.117±0.724、0.810±0.232。与癌旁组织相比，喉癌组织中SEMA3F mRNA的表达明显较低(t=28.201，P<0.001)，而NRP2 mRNA明显较高(t=39.389，P<0.001)，见图1。

图1 喉癌和癌旁组织中SEMA3F、NRP2表达

2.2 喉癌中SEMA3F与NRP2表达的相关性 相关分析结果表明，SEMA3F与NRP2 mRNA表达呈明显负相关(r=-0.561，P<0.001)，见图2。

图2 癌组织中SEMA3F与NRP2表达的相关性

2.3 SEMA3F、NRP2的表达与喉癌患者临床病理特征的关系 喉癌中SEMA3F、NRP2的表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关(均P<0.05)。与Ⅰ～Ⅱ期相比，Ⅲ～Ⅳ期患者癌组织中SEMA3F明显较低，而NRP2明显较高(均P<0.05)；与无淋巴结转移相比，伴淋巴结转移患者癌组织中SEMA3F明显较低，而NRP2明显较高(均P<0.05)，见表2。

2.4 SEMA3F、NRP2的表达与喉癌患者生存预后

表2 喉癌中SEMA3F、NRP2的表达与临床病理特征的关系

所有82例喉癌患者均随访三年，失访2例，死亡22例，3年生存率为72.5%(58/80)。SEMA3F高表达组和低表达组的3年总体生存率(OS)分别为90.2%(37/41)、53.8%(21/39)，低SEMA3F表达组患者3年OS显著低于高表达组患者(2=6.174，P=0.031)；NRP2高表达组和低表达组的3年OS分别为57.1%(24/42)、89.5%(34/38)，高NRP2表达组患者3年OS显著低于低表达组患者(2=5.623，P<0.001)，见图3。

2.5 影响喉癌患者生存预后的因素 以喉癌患者随访过程中的生存情况为因变量(1=死亡，0=存活，t=生存时间)，纳入肿瘤分期(赋值1=Ⅰ～Ⅱ期，2=Ⅲ～Ⅳ期)、淋巴结转移(1=伴淋巴结转移，0=无淋巴结转移)、SEMA3F(赋值1=低表达，2=高表达)、NRP2(赋值1=高表达，2=低表达)为自变量。多因素COX回归分析结果显示，喉癌组织中SEMA3F低表达、NRP2高表达、肿瘤Ⅲ～Ⅳ期及淋巴结转移是喉癌患者不良预后的危险因素，见表3。

3 讨论

喉癌的发生是一个多基因、多条信号通路参与的复杂过程，受到环境因素和遗传因素相互作用的双重调节。喉癌发生的危险因素包括吸烟、饮酒及职业危险因素暴露等，多种因素共同作用，导致细胞癌基因的过度激活、抑癌基因的失活及染色体杂合性缺失等改变，进而导致肿瘤的发生[9-10]。寻找喉癌关键的驱动癌基因或抑癌基因，揭示肿瘤发生的分子机制，对寻找新的喉癌早期诊断方案及临床治疗策略，具有重要意义。

图3 Kaplan-Meier生存分析SEMA3F、NRP2的表达对喉癌患者预后影响

表3 影响喉癌患者预后因素的多因素COX比例风险回归模型

SEMA3F位于染色体 3p21.3，是Semaphorin 家族的分泌轴突指导分子，在神经元发育和轴突传导中发挥重要功能[11]，SEMA3F还是大脑发育的重要调节因子[12]。除神经系统外，SEMA3F在肿瘤发生发展的生物学过程也发挥重要作用。研究表明，在肺癌和乳腺癌中SEMA3F 基因所在的染色体区域经常丢失，提示SEMA3F起到肿瘤抑制因子的作用[13]。然而，SEMA3F 在喉癌中报道尚少。本研究中，癌组织中SEMA3F mRNA的表达显著降低，表明SEMA3F在喉癌中可能发挥肿瘤抑制的作用。肿瘤中SEMA3F的表达下调与长链非编码(Lnc)RNA的表达调控有关。研究发现，LncRNA FAM83C-AS1能够通过稳定Zeste同源增强子2的表达，促进SEMA3F基因启动子区域H3K27me3位点甲基化，表观遗传学抑制SEMA3F转录及蛋白表达，进而促进结直肠癌肿瘤细胞的增殖及侵袭[14]。喉癌中SEMA3F表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关，提示SEMA3F低表达促进喉癌的恶性进展。有学者在结直肠癌的研究中发现，SEMA3F高表达患者淋巴结和远处转移发生率较低，生存期较长。机制上，SEMA3F 通过 PI3K-AKT 依赖性下调 ASCL2-CXCR4 轴来抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移[15]。Kieszkowski等[5]研究表明，SEMA3F亦参与肿瘤耐药性成的过程，即在肿瘤细胞体外培养过程中，梯度加用顺铂处理肿瘤细胞，结果SEMA3F表达显著上调，提示SEMA3F亦可通过对化疗药物耐药性形成，发挥促进肿瘤进展的作用。此外，本研究亦证实，SEMA3F低表达的喉癌患者生存预后较差，并且SEMA3F低表达是喉癌患者不良生存预后的独立危险因素。表明SEMA3F是喉癌患者预后的重要因素，值得深入研究。

NRP-2属于神经纤维蛋白家族成员，在肝细胞、黑色素细胞、内皮细胞、胰岛细胞和成骨细胞中均有表达，特别是在神经元和血管发育中发挥重要作用。NRP-2为 VEGF-C/D 的辅助受体，VEGF-C/D 是一种众所周知的淋巴管生成因子，在各种人类癌症的淋巴结转移中发挥重要作用[16]。在甲状腺癌及胃癌等恶性肿瘤中，NRP-2的高表达促进肿瘤生长、迁移和侵袭，患者的预后较差[17-18]。本研究中，喉癌中NRP-2 mRNA的表达明显较高。NRP-2 mRNA的表达受到微小RNA的转录后调控。研究表明，miR-486-5p能够结合NRP-2 mRNA的3＇非编码区，抑制NRP-2 mRNA的表达，而肿瘤中miR-486-5p表达降低，导致NRP-2 mRNA表达显著升高，进而促进肿瘤细胞的恶性增殖及转移[19]。此外，本研究发现NRP-2的高表达与较高的肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关。NRP-2作为VEGF-C的配体，其表达水平升高能够显著激活下游P38/MAPK信号通路，促进肿瘤细胞的恶性增殖及淋巴转移[20]。Schulz等[8]研究报道，肿瘤中NRP-2能够结合TGF-β受体，激活下游上皮间质转化信号通路，进而促进肿瘤细胞的迁移及侵袭。因此，喉癌中NRP-2可能作为一种原癌基因，促进肿瘤的发生发展过程。喉癌中NRP-2高表达是患者不良生存预后的独立危险因素，表明检测喉癌中NRP-2可能是预测喉癌患者生存预后的肿瘤标志物。NRP-2作为一种细胞表面分子，靶向NRP-2的治疗不仅能够抑制肿瘤的恶性进展，还能够改善对化疗药物治疗的抵抗，进而延长患者的生存时间[21]。

本研究中，喉癌中SEMA3F与NRP2 mRNA表达呈负相关，可能是SEMA3F与NRP2存在相互作用。SEMA3F与NRP2 mRNA表达与淋巴结转移状态关系密切，淋巴结转移状态是喉癌独立预后因素。肿瘤淋巴管生成是淋巴结转移中的关键过程，血管内皮生长因子 C(VEGF-C) 是促进淋巴管生成的最重要分子[22]。NRP2是 VEGF-C的重要受体，结合VEGF-C后促进恶性肿瘤的淋巴结转移[23]。SEMA3F是NRP2的信号素配体，可以与 VEGF-C竞争性结合 NRP2，发挥抑制下游信号通路的作用[24]。因此，SEMA3F可能通过结合并抑制NRP2的表达及功能，进而抑制肿瘤细胞淋巴转移能力。

4 结论

喉癌中SEMA3F mRNA表达降低，NRP2 mRNA表达升高，均与肿瘤分期及淋巴结转移有关，喉癌组织中SEMA3F低表达、NRP2高表达、肿瘤Ⅲ～Ⅳ期及淋巴结转移是喉癌患者不良预后的危险因素，可能成为新的喉癌诊断及治疗的新靶点。