王浩浩 李海松 王继升 赵琦 徐洪胜 韩亮

(1.北京中医药大学东直门医院，北京100700；2.北京中医药大学房山医院，北京 102400)

铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，该死亡方式依赖于细胞内铁和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，以脂质过氧化为特征[1]。铁死亡与多种疾病密切相关，很多领域都已经证实了细胞的铁死亡形式，如神经系统疾病、心血管系统疾病、消化系统疾病以及肿瘤等[2]，但是在生殖系统相关疾病的研究仍较为缺乏。精索静脉曲张(Varicocele，VC)是男科临床中的常见病、多发病，能够影响到睾丸的生精功能，导致精液质量下降，引起男性不育[3]。目前VC导致男性生精功能下降的发病机制尚不清楚。Gholirad等[4]研究表明，由于血流减少和睾丸温度升高，VC大鼠的睾丸中ROS含量升高，并沉积了过量的铁。基于这一观察结果，本研究推测VC可能引起大鼠睾丸中生精细胞铁死亡的增加从而导致了生精功能障碍。为了验证推测，本研究建立了实验性左侧精索静脉曲张(Experimental left varicocele，ELV)大鼠模型，通过检测铁死亡相关指标含量和相关调控蛋白的表达水平，探讨细胞铁死亡方式是否参与ELV睾丸损伤的病理过程。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 24只8周SD大鼠(购于北京华阜康生物科技股份有限公司)，SPF级，体重240～260 g，使用随机数字表法进行随机分组，手术A组和手术B组各6只，设假手术A组和假手术B组各6只作为对照。所有动物饲养在同样的标准环境中，自由进食、进水。本实验大鼠处理符合动物伦理要求，并经医院伦理委员会审核同意。

1.2 主要仪器与试剂 游标卡尺(日本三量)；正置光学显微镜(日本尼康)、成像系统(日本尼康)。ROS测定试剂盒(北京雅安达)、谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione peroxidase，GPX4)检测试剂盒(南京建成)、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)测定试剂盒(南京建成)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)测定试剂盒(南京建成)。兔抗大鼠核转录相关因子2(Nuclear factor E2 related factor2,Nrf2)抗体(Cell Signaling Technology公司)、RIPA裂解液(索莱宝)、30%丙烯酰胺(索莱宝)、预染蛋白marker(Thermo公司)、PVDF膜(Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立模型 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥(45 mL/kg)麻醉，腹部正中纵向切口，手术A组和手术B组参照Turner[5]经典造模方法，分离近下腔静脉的左肾静脉段，于左精索静脉和肾上腺静脉内侧、下腔静脉外侧置一直径约0.8 mm的改良后的金属杆，用4-0丝线将金属杆与左肾静脉一并结扎后拔出此杆，造成左肾静脉部分狭窄，同时将其余可见到的左侧睾丸静脉侧枝回流分离后完全结扎；假手术A组和假手术B组仅行左肾静脉分离但不结扎。术后动物连续7 d腹腔注射20万单位青霉素钠预防感染。

1.3.2 标本采集 假手术A组和手术A组于造模2周后进行取材，假手术B组和手术B组于造模4周后进行取材。取材时首先对大鼠进行腹腔麻醉，然后剖腹观察，使用游标卡尺测量左侧精索静脉直径，以左精索静脉比术前曲张2倍以上，且双侧肾脏无明显病变为选取标准，分别取出各组左侧睾丸。

1.3.3 HE染色 取所有大鼠左侧睾丸组织，生理盐水冲洗，投入10%福尔马林液固定，石蜡包埋，制成切片。石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色3～5 min，盐酸水溶液分化，氨水水溶液返蓝，水洗；切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水，入伊红染液中染色5 min；伊红染色至橘红色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观察各组大鼠左侧睾丸组织结构的病理改变。

1.3.4 睾丸组织ROS、GSH、GSH-PX、GPX4检测 将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10 min取上清，制备组织匀浆。采用ELISA法测定ROS、GPX4浓度，分光光度法测定GSH活性，比色法测定GSH-PX活性，均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.5 Western Blot检测睾丸组织中Nrf2蛋白表达 把组织剪切成细小的碎片，裂解液充分裂解，用玻璃匀浆器抽提总蛋白；制备SDS-PAGE 胶，电泳分离目的蛋白，转膜后封闭1 h，加入兔抗大鼠Nrf2抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤，加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤，最后以ECL显色，凝胶成像系统下扫描拍照，以β-actin为对照，运用Image J软件测定每个样本蛋白条带灰度值，并计算其与β-actin条带灰度值之比，以其比值作为Nrf2蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠ELV情况比较 手术A组和手术B组共12只SD大鼠经深度麻醉处死后，均见左侧精索静脉扩张且左肾无萎缩，测量两组精索静脉直径与相对应的假手术A组和假手术B组对比均具有统计学意义(P<0.05)，提示建模成功。假手术A组和假手术B组则均未见左侧精索静脉扩张，左肾亦未见萎缩。见表1。

表1 各组大鼠左侧精索静脉直径比较

2.2 各组大鼠左侧睾丸形态学变化比较 假手术A组和假手术B组大鼠左侧睾丸生精小管形态正常，各级生精细胞排列整齐，层次分明，结构清晰，管腔完整，精子释放好，管腔内见大量精子，支持细胞形态良好，间隙较紧密。手术A组大鼠左侧睾丸生精小管基膜损伤、变薄，各级生精细胞排列紊乱，管腔有脱落的生精细胞，管腔间隙增大，管腔内精子数量减少，支持细胞形态欠佳。手术B组大鼠左侧睾丸生精小管界膜增厚、褶皱，基膜变薄，生精细胞排列紊乱，各级生精细胞和支持细胞广泛脱落，精子细胞发育不良，精子生产低下，管腔内精子少见，支持细胞形态萎缩。见图1。

图1 大鼠左侧睾丸组织形态学改变比较(HE 100×)

2.3 各组大鼠左侧睾丸组织中ROS、GSH-PX、GPX4检测结果比较 与相对应的假手术A组和假手术B组相比，手术A组和手术B组大鼠左侧睾丸组织中ROS浓度均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，但GSH、GSH-PX活性与GPX4浓度均变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 大鼠左侧睾丸组织中ROS、GSH、GSH-PX、GPX4检测结果比较

2.4 各组大鼠左侧睾丸组织中Nrf2蛋白表达比较 与相对应的假手术A组和假手术B组相比，手术A组和手术B组大鼠左侧睾丸组织中Nrf2蛋白变化差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 大鼠左侧睾丸组织中Nrf2蛋白表达情况

3 讨论

世界卫生组织将VC列为男性不育的首要原因，目前研究发现VC的睾丸中广泛存在氧化应激现象[6]。氧化应激是指ROS和抗氧化剂水平失衡。ROS是一类具有高度活性的含氧基团，是细胞代谢过程中产生的副产物，包括过氧化氢、超氧化物、羟基、一氧化氮和二氧化氮等。生理条件下机体可产生一定程度的受控的ROS，这些ROS不仅对维持细胞代谢正常的环境非常重要，而且在精子成熟过程中起重要作用，如精子的获能和顶体反应，同时精浆内还存在着超氧化歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽氧化还原酶等对抗活性氧的酶清除系统，在生理情况下ROS的产生与对抗活性氧的酶清除系统处于一种动态平衡，维持着正常的生精过程[7]。如果这种平衡被破坏，则会导致氧化应激，过量的ROS可通过直接氧化损伤精子的质膜，导致生精细胞或精子DNA单链或双链破坏、断裂，DNA完整性受损，生精细胞也受到损伤，引起不育或发生胚胎缺陷[8]。多位学者研究[9-10]均发现VC时睾丸中的ROS明显升高，且与其严重程度呈正比。本实验结果也证实了这一点，与相对应的假手术A组和假手术B组相比，手术A组和手术B组ROS含量均明显升高，说明VC形成后精索静脉曲张大鼠睾丸内氧化与抗氧化系统失衡，氧化应激可能被激活。

氧化应激可以启动不同的细胞死亡途径，如凋亡、坏死以及铁死亡[11]。铁死亡是细胞死亡的一种独特的调节机制，和其他形式的细胞死亡形式不同，它的典型特征是铁依赖的脂质活性氧增加[12]。谷氨酸-胱氨酸转运体(System Xc-)/GSH/GPX4轴是哺乳动物体内主要的抗氧化系统之一，被认为在防止脂质过氧化介导的铁死亡中起着重要作用[13]。System Xc-能够高度特异性摄取胱氨酸，然后被GSH或硫氧还蛋白还原酶1还原为半胱氨酸，半胱氨酸反过来能够合成GSH[14]。GSH是重要的抗氧化剂，它可清除超氧根离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、过氧化物(LOOH)。GSH-PX是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它能够特异的催化GSH对过氧化氢的还原反应[15]。GSH是GPX4蛋白的辅助因子和合成底物，是GPX4蛋白发挥脂质修复功能所必需的[16]。GPX4是铁死亡的关键调节因子，它是一种脂质修复酶，在产生脂质信使分子通路中发挥重要功能，主要负责降解脂质过氧化物，移除有毒性的中间产物，通过将脂质过氧化物转化为无毒脂质来抵抗铁和氧依赖性的脂质过氧化[17]。GPX4的表达受Nrf2的调节，Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，具有抗炎、抗癌、维持细胞氧化还原平衡等功能[18]。本研究结果显示，与相对应的假手术A组和假手术B组相比，手术A组和手术B组Nrf2蛋白表达、GSH和GSH-PX活性以及GPX4浓度均无统计学意义，在两手术组中均没有发现和铁死亡相关的System Xc-/GSH/GPX4轴抗氧化系统的明显变化，说明暂时不能确定VC睾丸中生精细胞存在铁死亡的形式，氧化应激引起的生精功能障碍可能和细胞其他的死亡方式有关。

综上所述，虽然本研究实验结果为阴性，无法得出VC睾丸中生精细胞存在铁死亡的形式，但是仍然不能确切的否认其存在的可能。首先铁死亡过程不仅受System Xc--/GSH/GPX4轴影响，还受铁代谢途径、p53/SAT1/ALOX15通路、转录激活因子4(ATF4)等调控[19-22]，而本实验研究中检测调控铁死亡相关途径的敏感基因有限，除了Nrf2、GSH、GSH-PX、GPX4外，铁死亡抑制蛋白1(FSP1)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)等[23]其他相关的调控基因都没有得到检测，而且仅测了Nrf2的蛋白表达，其他指标的蛋白表达也没有检测。其次可能和VC形成的时间有一定的关系，在VC形成过程中睾丸并不均匀地受到应激反应的影响，虽然一些睾丸区域受到严重影响，导致生精小管破坏、精子生成停滞，但睾丸的其他部分可能受到的损害较小，仍然能够支持精子生成[24]，在这种情况下，睾丸损伤区域的分子变化有可能被轻度损伤区域所弥补，可能会掩盖铁死亡经典分子标志物的检测。这也解释了为什么临床中只一部分VC患者可以生育，而有的患者却不能生育。未来在实验条件允许的情况下，希望能够进一步完善铁死亡相关蛋白的检测，深入探讨睾丸生精细胞铁死亡的形式。

4 结论

精索静脉曲张睾丸中活性氧含量增加，氧化应激可能被激活，但是否启动了铁死亡的细胞死亡方式目前仍不能确定，尚需进一步深入研究。