郭 江,张克勤

(重庆医科大学附属第二医院泌尿肾病中心 400065)

膀胱尿路上皮癌是常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升，近15年增加了68.29%[1]。膀胱尿路上皮癌按病理类型可分为非肌层浸润性膀胱癌(non-invasive bladder cancer，NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(invasive bladder cancer，MIBC)。NMIBC易于复发，且部分复发患者易进展为MIBC，MIBC患者5年生存率仅为50%～60%[2]。因此找到新的治疗NMIBC的方法具有重要意义。近年来随着芯片技术、生物信息学、基因工程等生物技术的快速发展，为肿瘤发病机制的阐明和对肿瘤的诊治提供了新的思路[3]。本次实验利用生物信息学分析正常膀胱黏膜与复发性NMIBC差异表达基因，从中找到有价值的关键分子并进行实验验证，并探索靶分子在复发性NMIBC中的重要作用及临床意义，为复发性NMIBC的诊疗提供潜在的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1生物信息学材料

从美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information,NCBI)公共数据平台(Gene Expression Omnibus,GEO)下载基因芯片数据GSE13507(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgiacc=GSE13507)，该数据于2010年5月6日公开，最后更新于2020年5月20日。

1.1.2临床标本和细胞株

收集2018年1月至2019年12月本院泌尿外科手术切除的复发性NMIBC及对应癌旁组织13例，所有肿瘤组织标本均经病理学证实为膀胱尿路上皮癌，病例排除标准：治疗前接受放疗或介入治疗的患者。本实验通过本院伦理委员会批准(批号2017-4-190)。人膀胱尿路上皮癌细胞株(T24、5637、J82、UM-UC-3),人膀胱尿路上皮细胞SV-HUC-1储存于本院泌尿肾病中心实验室。

1.2 方法

1.2.1差异表达基因的筛选

使用GEO2R(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)对GSE13507芯片中正常膀胱黏膜与复发性NMIBC数据进行差异表达分析，分析结果按差异表达倍数(logFC)及P值升序选取前250个(Top250)基因作为分析对象，对基因进行基因本体(Go)分析和京都基因组百科全书(kegg)通路分析，涉及的生物学功能和信号通路使用Metascape数据库(www.metascape.org)进行注释和可视化，Min overlap≥3且P≤0.01被认为差异有统计学意义。

1.2.3关键基因筛选

在Top250基因中按P<0.05且|logFC|>2筛选获得显著差异表达基因并在GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn)中做生存分析，获得显著降低膀胱癌患者生存率的基因，并选择P值最小的基因作为关键基因，进行下一步试验验证。

1.2.4细胞培养

用F-12K专用培养基培育SV-HUC-1细胞，T24、5637、J82、UM-UC-3细胞在含10%胎牛血清(美国Hyclone)的RPMI-1640(美国Hyclone)培养基中培养，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中孵育。

1.2.5免疫组织化学

采用标准免疫过氧化物酶染色法进行免疫组织化学检测。组织切片的阳性染色率和染色强度由2名实验员依照免疫组织化学评分标准独立评估，按中位评分分为高表达组和低表达组。

1.2.6shRNA转染

shRNA干扰靶点如下： EFNB2-shRNA(敲低组),5′-CGA CAA CAA GTC CCT TTG TAA-3′;EFNB2-shRNA-control(对照组),5′-GTT CTC CGA ACG TGT CAC GTT-3′。按shRNA-mate(上海吉玛制药技术有限公司)说明书步骤转染以上序列入T24细胞株。

1.2.7实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

先用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA，再反转录为cDNA。最后使用TaqManUniversal Master MixⅡ试剂盒在Bio-Rad系统上进行qRT-PCR。引物序列：EFNB2正向5′-TAT GCA GAA CTG CGA TTT CCA A-3′；反向5′-TGG GTA TAG TAC CAG TCC TTG TC-3′；GAPDH正向 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′；反向5′-TAG CAC AGC CTG GAT AGC AA-3′。每个试验独立重复3次，采用2-ΔΔct法分析数据结果，GAPDH作内参，计算EFNB2 mRNA的表达水平。

1.2.8蛋白免疫印迹(Western blot)

使用RIPA裂解液裂解各组细胞，将提取的蛋白加入EP管中，煮沸10 min。BCA法检测蛋白浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后加入一抗EFNB2(1∶400)、Tubulin(1∶800)置4 ℃冰箱孵育24 h，随后取出常温下放置1 h，PBS洗涤3次，加入对应二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，滴加ECL发光液(重庆葆光生物科技有限公司)，置LI-COR曝光仪内进行曝光显影，以Tublin为内参，使用ImageJ分析蛋白条带灰度值。

1.2.9集落形成实验

将转染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24细胞接种到6孔板(8×102/孔)，在含5% CO2、37 ℃的孵箱里培养11 d后，用结晶紫溶液对菌落进行染色，计数细胞克隆数，观察细胞增殖情况。

1.2.10CCK-8实验

将转染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24细胞接种于96孔板(2.5×103/孔)，每孔加入含有10 μL CCK-8试剂(重庆葆光生物科技有限公司)的完全培养基100 μL。在5% CO2、37 ℃孵箱中分别培养4、12、20、28、36 h后，在450 nm处测定吸光度(A)值，检测细胞增殖能力。

1.2.11划痕实验

将细胞接种于6孔板(2.5×103/孔)，转染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control后培养细胞长至约90%以上，用200 μL无菌吸管头轻轻划伤细胞形成创面，然后用PBS冲洗角质形成细胞和碎片，并用无血清RPMI-1640替代完全培养基，在划痕后0 h和24 h拍照，评估创面面积,创面面积大小反应肿瘤细胞的迁移能力。

1.2.12Transwell细胞迁移及侵袭检测

将转染EFNB2-shRNA,EFNB2-shRNA-control的T24细胞重悬稀释至1.0×106/μL，接种到Transwel小室(美国BD Biosciences,FranklinLakes)上室，下室加入含20%血清的培养基诱导细胞迁移，孵育48 h，收集迁移到下室的细胞并染色计数，评估迁移能力；根据Transwell侵袭实验步骤，在上室底涂上基质胶(Matrigel，北京索莱宝科技有限公司)并加入转染的T24细胞，培养48 h后，收集下室细胞并染色计数以评估其侵袭性。染色计数方法：先棉签擦除上室细胞，再用无水甲醇固定15 min，结晶紫(北京索莱宝科技有限公司)染色20 min，最后每孔随机抽取5个区域进行细胞计数。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 差异表达基因的筛选

GSE13507芯片数据中有9个正常膀胱黏膜样本，23个复发性NMIBC样本，从差异表达基因Top250中筛选出前54个(Top54)显著差异表达基因，包括14个上调基因和40个下调基因，见图1、表1。

表1 Top54基因差异倍数及P值

续表1 Top54基因差异倍数及P值

续表1 Top54基因差异倍数及P值

2.2 差异表达基因Top250富集分析

富集分析显示差异表达基因主要参与有丝分裂细胞周期调控、细胞分裂DNA生物合成、染色质结合蛋白泛素化的正调控等，上述细胞功能均与肿瘤发生、发展密切相关，见图2。

2.3 关键基因的筛选

显著差异表达基因Top54在GEPIA2数据库作生存分析获得显著降低膀胱癌患者生存率的基因(图3)并按P值排序(表2)，选取P值最小基因 EFNB2为关键基因，进行下一步试验验证。

表2 生存分析P值及基因功能

2.4 EFNB2在临床样本及膀胱癌细胞系中的表达

用免疫组织化学法检测了临床样本膀胱癌及对应癌旁组织中EFNB2的表达，去验证其表达差异性。结果显示膀胱癌组织中EFNB2的表达水平显著高于对应癌旁组织，见图4A。与临床标本中的结果一致，T24、5637、J82和UM-UC-3细胞系中EFNB2的表达显著高于SV-HUC-1细胞，见图4C。同时发现，EFNB2在4种膀胱尿路上皮癌细胞中表达也存在差异性，其中T24细胞系中EFNB2的表达最高，5637，J82次之，而UM-UC-3表达最低(T24>5637>J82> UM-UC-3)，见图4B、C。因此，选取T24细胞株进行后续实验。

2.5 敲低EFNB2对T24细胞的增殖、迁移及侵袭的影响

与对照组比较，敲低组细胞增殖速度显著减慢，细胞克隆数显著减少，划痕未覆盖面积显著增加，细胞迁移及侵袭数显著减少，见图5。

3 讨 论

膀胱尿路上皮癌是我国常见恶性肿瘤，其中NMIBC易复发、进展，部分NMIBC易进展为MIBC,导致病情迅速发展、恶化，患者预后较差，成为当前我国肿瘤治疗的难点。本研究通过揭示复发性NMIBC与正常膀胱黏膜之间的基因表达差异，筛选出关键基因并体外实验验证，寻找NMIBC新的治疗靶点。

差异表达基因富集显示其生物学行为与肿瘤的发生及进展密切相关。通过富集结果笔者推测EFNB2可能通过上述生物学过程促进肿瘤细胞生长，研究显示EFNB2可促进多形性胶质母细胞瘤增殖和侵袭[4]，通过p53/p21和上皮间质转化(EMT)促进胰腺导管腺癌中的细胞增殖、迁移和侵袭[5]。

Ephrins家族是受体酪氨酸激酶亚家族的配体，Ephrin通过与Eph受体结合发挥其生物学功能，其中EFNB2是最大的配体[6]。Ephrins不仅是配体，也是信号受体，除了Eph/Ephrin通路外，Ephrin还可以通过反向信号，不依赖Ephrin受体发挥生物学作用，当细胞质Ephrin结构域磷酸化，导致细胞信号通路激活时，就会发生反向信号传递[7-8]。Eph/Ephrin通路与癌症的发生和进展有关[9]，已有研究表明，Ephrins过表达促进肿瘤细胞侵袭、迁移和血管生成[10]，EFNB2广泛表达于肿瘤血管，通过促进血管内皮前体细胞黏附于肿瘤部位，参与肿瘤血管生成[11]。已有多项研究显示，EFMB2高表达的卵巢癌[12]、子宫内膜癌[13]、食管鳞状细胞癌[14]、头颈部鳞状细胞癌[15]等多种实体肿瘤预后较差。

本研究中，临床人膀胱癌样本免疫组织化学实验显示EFNB2在复发性NMIBC中表达显著高于对应的癌旁组织，表明EFNB2可能参与了膀胱尿路上皮癌的发生发展。因此，笔者通过敲低EFNB2进一步探讨了EFNB2在膀胱尿路上皮癌细胞增殖、迁移及侵袭中的作用及可能的机制。体外实验CCK-8、集落形成实验表明下调EFNB2可抑制膀胱尿路上皮癌细胞的增殖。此外，EFNB2的反向信号转导证明在结直肠癌中驱动EMT，而EMT促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[16-17]。本研究划痕实验、Transwell实验显示EFNB2敲低后，细胞迁移及侵袭能力较对照细胞显著下降，这进一步证实了EFNB2促进了肿瘤细胞的迁移与侵袭。

综上所述，本研究通过生物信息学筛选，临床样本免疫组织化学分析及体外实验验证表明：EFNB2是促进NMIBC复发、进展的关键基因，EFNB2可能与复发性NMIBC的病理发生、发展密切相关，是一个潜在的复发性NMIBC治疗靶点。