张严匀，李 易，王 贺，张 曼，张苗苗

在正畸牙齿移动过程中，压力侧的牙周膜受压变窄，牙周膜血管破裂，出现血循环障碍，牙周组织中的细胞膜破裂，细胞死亡，出现典型的局部细胞坏死区，也称为玻璃样变区，这些坏死的细胞引发急性炎症反应，募集炎症细胞和破骨前体细胞到炎症区域，促进破骨细胞生成，导致骨吸收[1-2]。本课题组前期实验研究已发现坏死性凋亡是压力侧细胞死亡的方式之一[3]，抑制坏死性凋亡可下调压力侧炎性分子的水平[4]，影响破骨细胞的形成、分化，减缓正畸牙移动的速度[5]。坏死性凋亡是主要由受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)、受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)及混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)诱导的一类不依赖于caspase的细胞死亡方式，在引发细胞死亡的同时可诱导周围组织的免疫反应和广泛的炎症反应[6-7]，其中RIP3和MLKL是核心调节因子，被认为是检测坏死凋亡发生的生物标志物[8-9]，MLKL作为最终的执行蛋白，可在RIP3催化下发生磷酸化，继而发生寡聚化，引起质膜通透性的改变，细胞内Ca2+、Na+浓度增加，K+浓度减小,质膜完整性丧失，驱动坏死性凋亡[10]。

正畸力转化成化学信号受多种信号通路的影响，其中离子通道是牙周组织细胞信号传导的重要途径之一[11]。Piezo1是近年来新发现的一种机械敏感性离子通道，该通道可以响应不同形式的机械力刺激，如拉伸力、剪切应力、膜张力等，对 K+、Ca2+、Mg2+和Na+均可渗透，其中更偏向于Ca2+，在牙周组织及细胞中有丰富的表达，可有效地将物理力转化为相应的电化学反应[12-14]。它可以被特异性的机械敏感性离子通道抑制剂蜘蛛毒素多肽(grammostola spatulata mechanotoxin 4，GsMTx4)所阻滞，静态压应力可以激活人牙周膜干细胞膜上的Piezo1蛋白，经静态压应力预处理的牙周膜细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)与小鼠单核细胞系RAW264.7共培养中，Piezo1抑制剂抑制破骨细胞的形成[15]。已有研究证明Piezo1可被机械应力激活，增进Ca2+的内流，干扰细胞内Ca2+稳态，驱动内质网的应激系统，导致随后的细胞凋亡[16]。然而，在施加正畸力后Piezo1是否会影响到压力侧牙周组织发生的坏死性凋亡，尚未见报道。本实验建立大鼠牙齿移动的正畸模型，通过局部注射GsMTx4阻断压力侧牙周组织 Pizeo1通道，检测RIP3、MLKL表达量的变化，探讨Piezo1是否影响压力侧牙周组织坏死性凋亡，为临床正畸治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与构建大鼠牙移动模型

选用75只6～8周龄的雄性SD大鼠(辽宁长生生物实验室)，体重180～200 g，随机将其分为空白对照组(A组)，加力组(B组)，加力+抑制剂组(C组)，每组各25只。术前禁食12 h，选取左侧上颌牙弓为实验侧，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(0.1 mL/100 g)后，在上颌的左侧第一磨牙与中切牙间用结扎丝固定一段镍钛拉簧，将加力值设为50 g。大鼠牙移动模型构建完成后，对C组大鼠左上第一磨牙的近中牙周组织处每隔1 d注射一次GsMTx4药液，剂量为50 μL，浓度为48 μmol/L[17](图1)。本研究获得哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2 组织准备

分别于加力后 1、3、5、7、14 d采用心脏灌注的方法处死大鼠，取大鼠的左上颌磨牙及周围组织块，于多聚甲醛中固定48 h，EDTA脱钙42 d后，进行脱水、包埋，沿着大鼠牙体长轴的矢状方向进行厚度为5 um的连续切片。恒温65 ℃烤片2 h后，进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和免疫组织化学染色。

1.3 牙齿移动距离测量

取大鼠的上颌两侧磨牙及周围组织块,由同一人员使用数字游卡尺分别测量左侧和右侧的第一磨牙近中龈牙连接处与中切牙远中龈牙连接处之间的距离,右侧磨牙切牙间所测得距离与左侧磨牙切牙间所测得距离之差即为左侧上颌第一磨牙移动的距离,每个组织进行反复测量3次,最后取平均值。

1.4 HE染色

用苏木精染液对组织切片进行染色，时间约为5 min，盐酸酒精对组织切片进行分化，时间约为10 s后，置于温水中直至蓝色出现，伊红液中复染约3 min，应用中性树胶对其进行封固处理。

1.5 免疫组化检测压力侧RIP3、MLKL的表达

先将组织切片进行脱蜡至水、修复、封闭，然后分别滴加RIP3、MLKL一抗(1∶100稀释)，贴膜，放置于湿盒内，冰箱4 ℃条件下孵育过夜之后滴加二抗(1∶200稀释)，贴膜孵育后，进行显色、复染、脱水、二甲苯透明化处理，应用中性树胶对其进行封固处理，通过Image pro plus 6.0软件对染色后阳性表达细胞进行平均光密度测定。

1.6 统计学分析

采用SPSS 24.0通过ANOVA检验对所有数据进行统计学分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠正畸牙移动距离的比较

A组的正畸牙齿在各个时间点均无移动，B组和C组的移动距离均随时间而增加。其中B组牙齿移动距离在3 d内明显增加，随后增加相对减慢，7～14 d趋于稳定，而C组牙齿移动距离在3 d内同样明显增加，随后趋于稳定，5～7 d移动距离增加相对减缓，7～14 d再次趋于稳定。与B组相比较，C组的牙齿移动距离在各时间点均明显减小(P<0.05)，如图2所示。

2.2 正畸加力后压力侧牙周组织变化

HE染色显示：A组牙周膜形态较好，其纤维排列较为规律、整齐，牙槽骨的表面平整，未发现骨吸收陷窝；B组，3 d时受压侧牙周膜的宽度开始变得窄缩，其纤维排列变得紊乱，7 d时受压侧牙槽骨边缘部位出现骨吸收陷窝，14 d时，牙周膜的宽度恢复接近于A组，未见明显的骨吸收陷窝，牙周组织形态恢复正常(图3)。

2.3 压力侧RIP3免疫组化染色结果

A组RIP3的表达量在各时间点均无明显差异(P>0.05)。施加正畸力后，B组RIP3的表达量增加至5 d时达到高峰，随后开始进行下降，在3、5 d时表达量显著高于A组(P<0.05)。当使用GsMTx4抑制Piezo1时，C组RIP3的表达量在3、5 d时显著低于B组，其中在5 d时C组RIP3的表达量仍高于A组，其差异有统计学意义(P<0.05)(图4～5)。

2.4 压力侧MLKL免疫组化染色结果

A组MLKL的表达量在各时间点均无明显差异(P>0.05)。施加正畸力后，B组MLKL表达量增加至3 d时达到高峰，随后开始下降，在3～7 d时表达量显著高于A组(P<0.05)。当使用GsMTx4抑制Piezo1时，C组MLKL的表达量在3～7 d时均显著低于B组，但仍均高于A组，其差异有统计学意义(P<0.05)(图6～7)。

3 讨 论

Piezo1是一种可以对戳刺、拉伸、剪切力等各类形式的机械刺激做出反应,并具有高度机械敏感性的离子通道，该通道呈一种类似于三聚体螺旋桨状的结构，利用杠杆原理将不同形式机械刺激传递到中心离子通道孔区域，使得离子通道开放，引起Na+、Ca2 +、Mg2 +等多种离子内流，诱导膜电位去极化，从而有效完成机械转导的过程，为机体参与功能调节等多种生理过程所必需的[13,18]。Piezo1通道可被GsMTx4特异性阻断，GsMTx4是一种从蜘蛛毒液中分离出来的富含半胱氨酸的多肽，其抑制作用类似于一种门控修改器，阻滞Piezo1的活动是通过插入通道和细胞膜脂质临界面，并对通道施加压缩应力使其变为关闭结构从而选择性地阻断该阳离子通道[17,19]。在牙齿移动期间，牙周膜细胞可以感知机械应力，在维持牙周稳态和调节牙周组织重塑方面起着至关重要的作用[20]。在本实验发现中，与单纯加力组大鼠牙齿移动距离相比，加力+抑制剂组正畸牙向近中移动的距离明显缩短，说明注射GsMTx4后可使大鼠牙齿移动速度减慢，提示Piezo1通道可能在正畸牙齿移动过程中起着机械转导作用，并在维持正畸牙齿速度中起着重要的调节作用。值得注意的是阻断Piezo1通道后，牙齿移动速度变缓慢但并没有完全停止，说明在正畸牙齿移动中，还存在其他信号转导通道与Piezo1协同完成其机械转导的过程。

在正畸力的作用下，牙周膜细胞通过多种生物力学信号转导通路的调节，可将外界力学信号转化为生物化学变化引起牙周组织代谢的改变及牙槽骨的改建，实现正畸牙齿的定向移动[21]。本课题组前期实验已发现坏死性凋亡作为压力侧细胞坏死机制之一[3]，可下调压力侧白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)炎性因子的分泌水平[4]，影响破骨细胞的分化成熟，阻碍大鼠正畸牙的移动[5]。RIP3与MLKL是导致坏死性凋亡发生的两个关键信号因子，RIP3与RIP1结合并相互作用，通过磷酸化的方式激活，进而招募下游分子MLKL并催化其发生磷酸化，从而触发坏死性凋亡的生物开关，致使质膜发生破裂，其内容物大量释放，进而诱发局部的炎症损伤[22-23]。此外，已有研究证明RIP3促进炎性细胞因子的表达可以不依赖于坏死性凋亡通路，其在缺乏坏死性凋亡效应物MLKL的情况下，可促进Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3)炎症小体的激活及IL-1β炎性因子的成熟和分泌[24]。

本实验结果显示，加力组压力侧RIP3与MLKL的表达量均呈先增高后下降的趋势，不相同的地方是RIP3的表达量在3～5 d时显著增高，而MLKL的表达量在3～7 d时显著增高，这均与牙齿移动速度的趋势基本相一致，提示坏死性凋亡可能参与正畸力作用之下的鼠牙压力侧牙周组织的重建，影响牙齿移动的速度。本实验中大鼠牙齿在正畸力的作用下均在3 d内移动速度最快，其中单纯加力组RIP3的表达量在3 d时显著高于对照组，提示坏死性凋亡可能发生于正畸加力初期，并有加速压力侧牙周组织改建的作用，而使用抑制剂后，在3 d时RIP3的表达量显著低于单纯加力组并与对照组相比较无显著差异，且正畸牙齿移动距离明显缩短，说明GsMTx4在3 d时的抑制作用较为明显，GsMTx4可通过抑制Piezo1通道减少RIP3的表达量并下调牙齿移动距离。此时，抑制剂组RIP3的表达量虽与对照组无显著差异，但大鼠牙齿仍在3 d内移动最快，这些结果表明正畸牙齿的移动是一个复杂的过程，受多种因素的影响，坏死性凋亡只是影响牙齿移动的其中一个因素。加力时使用GsMTx4后，RIP3与MLKL的表达量与单纯加力组在不同时间点相比较有所下降，说明抑制Piezo1通道，可下调压力侧牙周组织坏死性凋亡的发生，从而抑制破骨细胞的生成和分化，阻碍牙齿移动。然而在坏死性凋亡发生的过程中，MLKL作为RIP3的下游分子，却与RIP3表达量变化并不完全一致，这说明RIP3可能还通过别的途径参与和坏死性凋亡无关的其他信号通路来影响牙周组织的改建，推测RIP3在独立于其激酶功能和底物MLKL情况下，可能通过促进caspase-8的活性来激活与NLRP3相关的caspase-1，进而调控炎性细胞因子的释放，介导压力侧牙周组织的炎症反应，同时也提示Piezo1抑制剂GsMTx4在不同时间点对RIP3参与的不依赖于MLKL的其他炎症通路可能同样起着很大程度的抑制作用，但具体途径与机制尚不清楚，还需进一步研究。

综上所述，本实验通过建立大鼠牙齿移动的正畸模型，发现Piezo1通道在大鼠正畸牙齿移动过程中可能起着机械转导的作用，阻断Piezo1通道可减少正畸牙压力侧牙周组织坏死性凋亡的发生，影响牙周组织改建，阻碍正畸牙齿的移动，然而Piezo1影响坏死性凋亡的具体分子机制尚不清楚，仍需要结合更多的实验进一步阐明。