钟文峰，张兰兰，胡懿，施文婷，黎桃敏，彭杰宝，梁志毅（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

甘草在我国有“十方九草”之说，被称为中草药的国老[1]，为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflataBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根茎。其性平，味甘，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效[2]。现代研究表明，甘草主要含有三萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类、二苯乙烯类等化学成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫、肝脏保护、抗纤维化等多种药理活性[3-7]。

甘草配方颗粒是由甘草饮片经水提、浓缩、干燥、制粒等现代制剂技术制成的一种颗粒剂，具有易于携带、免煎易服、疗效确切等优点。甘草在各类复方配伍中较为常见，目前关于甘草化学成分和药理作用的研究报道较多[3-8]，尚无甘草饮片与其相关制剂质量相关性研究的报道。本研究采用UPLC 法分别建立甘草饮片、水煎液、配方颗粒的指纹图谱，并比较三者UPLC 指纹图谱之间的相关性和差异性，探讨甘草配方颗粒制备过程中有效成分的量值传递情况，以期为其生产过程的质量控制和临床安全有效用药提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290 型超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；XP26 型百万分之一天平、ME204E 型万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；Milli-Q Direct 型超纯水系统（德国Merck 公司）；SODA-12 型喷雾干燥仪（上海大川原干燥设备有限公司）；LGS20 型干法制粒机（南京迦南科技有限公司）；YRE-501 型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；DLSB-5/20 型低温冷却液循环水泵（郑州长城科工贸有限公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

甘草苷（批号：111610-201908，纯度：95.0%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度：96.2%）（中国食品药品检定研究院），甘草素（批号：wkq18030505）、异甘草苷（批号：wkq18042008）、芹糖甘草苷（批号：wkq19021306）（纯度≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司）；乙腈、甲醇为色谱纯（德国Merck 公司），磷酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。甘草药材（编号S1 ～S15）经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为正品，均为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎，其中S1 ～S8 来源于甘肃，S9 ～S15 来源于内蒙古。甘草饮片（Y1 ～Y15）由15 批甘草药材按照2020年版《中国药典》一部甘草项下饮片炮制规定炮制[2]；甘草水煎液（T1 ～T15）由15 批甘草饮片按照《医疗机构中药煎药室管理规范》的相关煎煮要求制备；甘草配方颗粒（P1 ～P15）由水煎液经浓缩、干燥、制粒等步骤制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[9]

色谱柱：Acclaim RSLC 120 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.2 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脱（0 ～1 min，5%～27%A；1 ～2 min，27%A；2 ～10 min，27% ～46%A；10 ～16 min，46% ～64%A；16 ～24 min，64% ～95%A；24 ～25 min，95%A）；柱温：30℃；流速：0.3 mL·min－1；进样体积：1 μL；检测波长：237 nm。

2.2 混合对照品溶液的制备

取甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、甘草素、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 分别含81.700、76.930、76.930、107.310、136.191 μg 的混合对照品溶液（甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207）。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 甘草饮片供试品溶液 取甘草饮片粉末（过三号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称重，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 甘草水煎液供试品溶液 精密吸取混合均匀的甘草水煎液3 mL，置25 mL 量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 甘草配方颗粒供试品溶液 取甘草配方颗粒，研细，取约0.1 g，精密称定，照“2.3.1”项下方法制备，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液及供试品溶液，进样测定，结果如图1 所示，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应的保留时间处具有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 专属性试验UPLC 色谱图Fig 1 UPLC chromatogram of specific test

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样6 次，计算得各成分峰面积的RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取甘草饮片（编号Y1），精密称定，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别于制备0、4、8、12、24 h 后进样测定，以3 号峰、6 号峰、10 号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取甘草饮片（编号Y1）6 份，精密称定，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以3 号峰、6 号峰、10 号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 UPLC 指纹图谱的建立与相似度评价

2.5.1 指纹图谱的建立 分别取15 批甘草饮片、水煎液和配方颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版”对色谱图进行匹配，形成共有模式图，并分别建立对照指纹图谱R1、R2、R3，见图2 ～4。经过比较分析后确定甘草饮片、水煎液、配方颗粒的UPLC 指纹图谱基本一致，均有12 个共有峰。通过与对照品图谱对比，确定2号峰为芹糖甘草苷，3 号峰为甘草苷，5 号峰为异甘草苷，6 号峰为甘草素，10 号峰为甘草酸。

图2 15 批甘草饮片的UPLC 指纹图谱堆叠图Fig 2 UPLC fingerprints of 15 batches of licorice pieces

图3 15 批甘草水煎液的UPLC 指纹图谱堆叠图Fig 3 UPLC fingerprints of 15 batches of licorice decoction

图4 15 批甘草配方颗粒的UPLC 指纹图谱堆叠图Fig 4 UPLC fingerprints of 15 batches of licorice formula granules

2.5.2 相似度评价 将15 批甘草饮片、水煎液、配方颗粒UPLC 指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版”软件，计算各批次甘草饮片、水煎液、配方颗粒UPLC 指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度，结果见表1。15 批甘草饮片、水煎液、配方颗粒UPLC 指纹图谱与其相应对照指纹图谱（R1、R2、R3）的相似度均大于0.900，表明不同批次甘草饮片、水煎液、配方颗粒的主要化学成分组成基本一致，质量较为稳定。

表1 甘草饮片、水煎液和配方颗粒UPLC 指纹图谱的相似度评价Tab 1 Similarity of licorice pieces，decoction and formula granules

2.5.3 对照指纹图谱的比较 将15 批甘草饮片、水煎液和配方颗粒指纹图谱生成的对照指纹图谱R1、R2、R3 导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版”软件，结果见表2、图5。与甘草饮片相比，水煎液和配方颗粒的相似度分别为0.994 和0.993，水煎液和配方颗粒指纹图谱相似度为1.000，表明甘草饮片、水煎液与配方颗粒成分基本一致，指纹图谱相关性良好，在提取、浓缩、干燥、制粒过程中，其主要成分无明显变化。

图5 甘草饮片对照指纹图谱（R1）、水煎液对照指纹图谱（R2）和配方颗粒对照指纹图谱（R3）Fig 5 Reference fingerprints of licorice pieces，decoction and formula granules by UPLC

表2 甘草饮片、水煎液、配方颗粒对照指纹图谱的相似度评价Tab 2 Similarity of reference fingerprints of licorice pieces，decoction，formula granules

2.6 化学模式识别分析

2.6.1 共有峰相关性分析 采用SPSS 26.0 软件，以15 批甘草饮片、水煎液和配方颗粒共45 个样品各特征峰的“峰面积占比”值（各特征峰峰面积占特征峰总面积的比例）为变量进行皮尔逊相关性分析，结果见表3。甘草饮片、水煎液、配方颗粒12 个共有峰均具有极显著的正相关性。

表3 甘草饮片、水煎液、配方颗粒指纹图谱共有峰的相关性分析Tab 3 Correlation analysis of common peaks in fingerprints of licorice pieces，decoction and formula granules

2.6.2 热图聚类分析[10]以12 个共有峰的峰面积为变量，采用对数归一化法，以Euclidean平方距离为度量标准，利用HemI 1.0 软件对15 批甘草饮片、水煎液和配方颗粒UPLC 指纹图谱进行热图和聚类分析，结果见图6。热图聚类分析结果显示，甘草饮片、水煎液和配方颗粒中化学成分组成一致，45 批样品可聚为3类。Y1 ～Y3、Y5、T1、T3 ～T5、T9、P1、P2、P4、P5、P9 聚为一类，Y4、Y6 ～Y15、T2、T6 ～T8、T10 ～T15、P3、P6 ～P8、P10 ～P15 聚为一类，P3 单独聚为一类。表明饮片、水煎液、配方颗粒三者之间无显著性差异，且水煎液与配方颗粒的内在成分含量更为接近。

图6 甘草饮片、水煎液和配方颗粒UPLC 指纹图谱热图聚类分析图Fig 6 Heat map cluster analysis of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules

2.6.3 主成分分析 采用SPSS 26.0 软件，对15批甘草饮片、水煎液和配方颗粒共45 个样品各特征峰峰面积的标准化值进行主成分分析，主成分结果以特征值＞1 为标准提取得到3 个主成分[11]，计算得特征值和方差贡献率见表4，主成分因子载荷矩阵见表5。由结果可知，前3 个主成分累积贡献率为82.807%，表明提取的3 个主成分能反映甘草指纹图谱的大部分信息。主成分1 的特征值为6.205，方差贡献率为51.705%，载荷较高的峰有峰1、芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草苷、甘草素、峰7、峰8、峰9、甘草酸，表明这9 个峰主要反映主成分1 的信息；主成分2 的特征值为2.608，方差贡献率为21.733%，载荷较高的峰有峰11，表明这个峰主要反映主成分2 的信息；成分3 的特征值为1.124，方差贡献率为9.369%，载荷较高的峰有峰4、峰12，表明这2 个峰主要反映主成分3 的信息。由图7 可知，甘草饮片与其他样品距离较远，表明甘草饮片水提液中的化学成分与饮片中的化学成分存在一定差异，这可能与溶剂极性有关；水煎液与配方颗粒样品相互交错，距离较小，表明甘草水煎液与配方颗粒之间差异较小[12]。

图7 甘草饮片、水煎液和配方颗粒UPLC 指纹图谱主成分得分图Fig 7 PCA score plot of principal component analysis of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules

表4 UPLC 指纹图谱主成分分析特征值及方差贡献率Tab 4 Eigenvalues and variance contribution rate of principal component analysis of UPLC fingerprint

表5 UPLC 指纹图谱主成分因子载荷矩阵Tab 5 Principal component factor loading matrix of UPLC fingerprint

2.6.4 正交偏最小二乘判别分析[13]采用SIMCA 14.1 软件，以15 批甘草饮片、水煎液和配方颗粒共45 个样品各特征峰单位峰面积（峰面积与取样量的比值）为变量进行正交偏最小二乘判别分析，结果见图8 ～9。由模型参数可知，数据矩阵的解释率参数R2X（cum）＝0.953，模型区分参数R2Y（cum）＝0.714，模型预测参数Q2＝0.609，均＞0.500，表明该数学模型稳定可靠[14]。45 个样品可分成3 类，以VIP 值＞1 为提取标准，得到甘草苷、芹糖甘草苷和峰12 是影响分类的主要标志性成分。

图8 甘草饮片、水煎液和配方颗粒UPLC 指纹图谱OPLS-DA 得分图Fig 8 OPLS-DA score plot of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules

3 讨论

中药配方颗粒是基于中药现代化、国际化形势下对传统中药饮片的一种补充[15]。首批160 个中药配方颗粒国家标准经国家药品监督管理局颁布，已于2021年11月1日正式实施，中药配方颗粒国家标准的落地执行将有助于实现安全性、有效性等多方面的整体质量控制。目前关于中药配方颗粒与其饮片、水煎液的对比研究，大多以单一成分的量值传递进行评价，无法全面反映其整体的质量传递情况。中药指纹图谱技术是国际公认的中药以及天然药物质量控制最为有效的手段，是评价中药优劣、真伪鉴别、质量控制和谱效关系研究的有效方法。目前应用指纹图谱技术结合化学计量学方法评价中药及其相关制剂质量已成为行业研究热点。

国家药品监督管理局颁布的甘草配方颗粒国家标准选用的药材基原为甘草，因此，仅对基原为甘草的甘草饮片、水煎液、配方颗粒指纹图谱相关性进行研究。研究结果表明，甘草饮片、水煎液、配方颗粒的HPLC 指纹图谱均有12 个共有峰，其对照指纹图谱间的相似度均大于0.99，且各共有峰均成显著正相关，说明三者的化学组成基本一致。主成分分析和聚类分析均表明水煎液与配方颗粒的质量更为相近，OPLS-DA 筛选出3 个导致三者质量差异的标志性成分，其中峰12 未被指认，后期可采用高效液相-质谱联用技术对其进行分析。总体来说，甘草配方颗粒在其生产过程中，其主要成分并未发生明显变化，饮片、水煎液、配方颗粒三者间的质量基本一致。在配方颗粒国家标准研究中会对成品的稳定性进行考察，且饮片在适宜条件下保存的质量也较稳定，故猜测饮片和配方颗粒放置一段时间后，甘草饮片、水煎液、配方颗粒的质量基本不会发生变化，但还需后续进行实验验证。将指纹图谱技术应用于中药配方颗粒的生产过程监控，克服了单一成分信息量不全的缺点，能较全面地反映甘草饮片、水煎液和配方颗粒间的化学成分传递情况及其相关性和差异性，可为甘草配方颗粒的质量控制及临床使用提供参考。

图9 甘草饮片、水煎液和配方颗粒UPLC 指纹图谱VIP 值Fig 9 VIP of UPLC fingerprint of licorice pieces，decoction and formula granules