涂尾龙，吴华莉，张莺莺，王洪洋，黄 济，曹建国，卫金良，甘叶青，唐赛勇，谈永松*

（1.上海市农业科学院 畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海种猪工程技术研究中心，上海 201106；3.上海市嘉定区动物疫病预防控制中心，上海 201800）

梅山猪是我国南方太湖流域具有高产仔数特性的地方品种，曾经被誉为生猪产仔冠军，其肉质鲜美［1］。目前梅山猪有4个保种场：上海市嘉定区梅山猪育种中心、昆山市种猪场、江苏农林职业学院及太仓市种猪场。按体型大小分为中梅山猪和小梅山猪，嘉定梅山猪属于中梅山猪。气喘病（Enzootic Pneumonia， EP）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma Hyopneumoniae， Mhp）引起的猪支原体肺炎，具有高度传染性、致病率和低死亡率［2］。嘉定梅山猪时有气喘病发生，尤其是在寒冷冬季或季节交替的时节，会给猪场造成重大的经济损失。即使在有免疫后，仍有部分猪发病，难以根除。2017年，朱效俊等［3］在研究不同支原体疫苗对梅山猪气喘病的影响中发现，支原体疫苗瑞倍适免疫过的梅山猪，50日龄的梅山猪抗体阳性率为50%，160日龄的梅山猪抗体阳性率为55.56%，免疫效果并不佳。本研究以嘉定梅山猪为试验对象，在冬季气喘病高发时，检测气喘病发作的梅山猪血液中血常规、生理生化及免疫指标，分析并找出其差别。并以此为标准，在各个季节对梅山猪群体进行筛选，找出梅山猪气喘病的潜在群体，进行采样，为进一步筛选梅山猪气喘病的相关基因及基因表达量的规律提供参考，从而更好地指导梅山猪筛选抗气喘病猪的选育工作。

1 材料与方法

1.1 试验动物

上海市嘉定区梅山保种场，纯种梅山猪60头，其中30头具有气喘病症状， 30头正常。

1.2 血液采集

使用医用的采血管和采血针，前腔静脉采集血液10 mL，分装2管：1管为加抗凝剂，用于检测血常规指标；另外1管不加抗凝剂，用于离心，提取血清，用于检测生化、脂肪代谢、微量元素和免疫等指标。

1.3 检测指标

1.3.1 血常规指标 使用迈瑞BC-30全自动血液分析仪检测梅山猪的血常规指标，包括：白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞比积（HCT）、平均红细胞容积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）、红细胞分布宽度标准差（RDW-SD）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、血小板分布宽度（PDW）、平均血小板体积（MPV）、血小板大细胞比率（P-LCR）、血小板比容（PCT）、中性粒细胞绝对值（NEUT）、淋巴细胞数（LYMPH）、单核细胞数（MONO）、嗜酸性粒细胞数（EO）、嗜碱性粒细胞（BASO）、中性粒细胞百分率（NEUT%）、淋巴细胞百分率（LYMPH%）、单核细胞百分率（MONO%）、嗜酸性细胞百分率（EO%）、嗜碱性细胞百分率（BASO%）。

1.3.2 血清生化指标、脂肪代谢指标和微量元素 使用普朗SMT100仪器检测梅山猪血生化、脂肪代谢、微量元素指标，包括：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、血清白/球蛋白（A/G）、谷氨酪转肽酶（GGT）、血糖（GLU）、尿素氮（Urea）、肌酐（Crea）、钙（Ca）、磷（P）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、钾（K）、钠（Na）、血清氯（Cl）、血清胆碱酯酶（CHE）。

1.3.3 免疫指标 购买ELISA试剂盒检测梅山猪免疫调节因子指标IL-2、IL-4、IL-8；检测天然免疫因子IFN-γ和TNF-α；检测蛋白抗体IgA、IgG、IgM；补体因子C3、C4。

1.4 数据分析

所有图表数据均采用SPSS 26.0和Excel 2003软件进行统计分析，结果用Mean±SE表示，并对数据做独立样本t检验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 梅山猪气喘病的血液常规指标

由表1可知，血液常规指标方面，相对于参考值，气喘病组的试验猪血液常规指标部分出现异常，具体为气喘病组的试验猪血液WBC、NEUT、NEUT%、LYMPH和LYMPH%大于参考范围最大值，而HCT、PDW小于参考范围最小值；正常组均值均在参考范围值之内，但统计分析时也有个体个别指标在参考范围外。两组试验猪之间WBC、P-LCR、NEUT、NEUT%、 RDW-SD和LYMP这6项指标有极显著差异（P＜0.01），HCT 、MONO和LYMPH%这3项指标有显著差异（P＜0.05），其他指标无显著差异（P＞0.05）。

表1 两组梅山猪气喘病的血液常规指标

2.2 梅山猪的血清生化指标、脂肪代谢指标和微量元素

2.2.1 梅山猪的血清生化指标 由表2可知，血清生化指标方面，相对于参考值，两组都有相关指标出现异常。其中，气喘病组梅山猪的血清ALT、AST、ALP、Urea和CK这5项指标大于参考范围最大值，正常组梅山猪的血清中AST、ALP这2项指标大于参考范围最大值。两组试验猪在ALT、ALP、Urea这3项指标上有极显著差异（P＜0.01），AST有显著差异（P＜0.05）。

表2 两组梅山猪气喘病的血清生化指标

2.2.2 梅山猪的血清脂肪代谢指标 由图1可知，梅山猪气喘病的血清脂肪代谢相关指标中，两组试验猪在LDH指标有显著差异（P＜0.05），GLU、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C和CHE这些指标无显著差异（P＞0.05）。

图1 两组梅山猪气喘病的血清脂肪代谢相关指标

2.2.3 梅山猪的血清微量元素 由图2可知，两组试验猪在微量元素相关指标方面均无显著差异（P＞0.05）。

图2 两组梅山猪气喘病的血清微量元素相关指标

2.3 梅山猪的血清免疫指标

从梅山猪气喘病血清免疫指标检测结果我们可以看出（图3），两组试验猪在IgA 、IgG2项指标上有极显著差异（P＜0.01），在IL-2和IFN-γ这2项指标上有显著差异（P＜0.05），其他指标无显著（P＞0.05）差异。

图3 两组梅山猪气喘病的免疫指标

3 讨论

3.1 梅山猪的血常规指标分析

在血常规指标中，白细胞分为5类：淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞。它们是机体内与细菌、病毒、支原体等战斗的“警察部队”，每种白细胞具体对抗的病原体也不一样，其中淋巴细胞负责对抗支原体。正常情况下，机体血液中免疫指标如粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等都处于一个范围内波动不变，这是机体免疫功能正常的表现［4-5］。但是，当机体自身发生疾病或者遭受病原微生物侵染时，自身的免疫系统就会针对性地建立防御系统，自身免疫系统的强弱对机体的恢复起决定性作用［6］。另外，由于地方猪在控制淋巴细胞亚类上有其独特的遗传特征，这使得地方猪没有明显的免疫缺陷而有较高的抵抗力［7］。动物机体的血常规指标是最直接反映动物健康状态的指标，本研究中的气喘病组梅山猪血常规指标中的WBC、LYMPH指标超过参考范围值最大值，也显著高于正常组（P＜0.05），说明气喘病组的梅山猪中存在疾病，而且是病毒或者支原体，机体对病原产生抵抗。正常组梅山猪也有个别指标超出参考范围最大值，这可能是因为个别猪也处于亚健康或者疾病状态，但无明显症状。当然，如果是不同品种间，也可能会出现显著差异（P＜0.05），这是因为动物不同品种间控制各项指标的基因座也有显著差异［8］，但本试验的猪均为同一个品种，因而排除这种可能，只能是疾病的因素。2018年，陈少康等［9］研究发现，中性粒细胞可以作为诊断猪群是否即将感染或已经处于感染初期的一个辅助指标。本研究中，气喘病组梅山猪的NEUT、NEUT%指标超出其参考值范围最大值，且两组梅山猪之间存在极显著差异（P＜0.01），进一步验证了气喘病组的梅山猪群体处于疾病状态。P-LCR、RDW-SD这2项指标值高于参考值范围最大值，其原因可能是动物机体存在炎症［10］。本研究中，两组梅山猪血液中的P-LCR、RDW-SD这2项指标均在参考值范围内，说明了两组梅山猪机体内还未发生炎症，但气喘病组的梅山猪群体极显著（P＜0.01）高于正常组的梅山猪群体，气喘病组梅山猪群体可能即将出现炎症。HGB、MCH和MCHV等指标均在参考值范围内，两组也无显著差异（P＞0.05），说明总的运氧能力还是处于正常状态，两组梅山猪无显著差异（P＞0.05），气喘病组梅山猪短期无重危症状。从梅山猪的血常规指标上来看，基本还是能反映出两组梅山猪的健康状况，从而进一步为我们筛选抗气喘病梅山猪提供数据参考。

3.2 梅山猪的血清生化指标、脂肪代谢指标和微量元素分析

肝脏是动物机体进行转化和代谢的主要场所，动物血清中的生化指标是判断动物机体是否受损伤的重要依据。ALT和AST主要存在动物机体的肝细胞的胞浆和线粒体中，这2项指标直接反映了肝细胞或线粒体的受损状态［11］。ALT还是肝脏参与氨基酸代谢中活性最高的转氨基活性酶，当肝脏受损时会有大量的ALT进入血清［12］。本研究中，气喘病组梅山猪ALT异常，且与正常组梅山猪有极显著差异，说明气喘病组梅山猪肝脏已经受损；但在AST指标方面，两组试验猪都表现异常，且差异极显著，这可能和品种有关，或者是因为正常组的梅山猪有个体是肝脏受损的。ALP是一种广泛存在于机体肝脏、骨骼、肾脏等各组织中的酶［13］，不是单一的酶，是一组同工酶，这种酶能催化核酸分子脱掉5′磷酸基团，从而使得DNA或者RNA片段的5′-P末端换成5′-OH末端。本研究中的两组试验猪ALP都出现异常，两组间也出现极显著差异，这可能是由于梅山猪在骨骼方面都存在或多或少的疾病而导致的，气喘病组梅山猪群体由于气喘病导致骨骼疾病更加明显，使得碱性磷酸酶异常。TP、GLOB、ALB、A/G等指标和蛋白质的代谢有关，血清中ALB的含量越高，A/G 值越大就越有利于蛋白质的沉积［14］。血清中CHOL、TG含量是衡量动物体内脂肪代谢，能反映出血栓形成、扩张血管等的重要指标［15］。CHOL是反映血液血脂方面的指标，2015年刘科等［16］对融水小型猪F1代血的生化指标检测中发现，CHOL是反映血脂和肥胖的一种重要指标。本研究中梅山猪是地方品种猪，饲养时间长，肥胖，完全有可能导致血清中的胆固醇含量超标，两组试验猪的CHOL含量均超过参考值范围，但无显著差异（P＞0.05）。两组GLU均偏高，但无显著差异，这可能是由于梅山猪的品种问题，胆小应激反应大，采血应激引起。Urea是反映肾功能的指标，气喘病组梅山猪Urea指标异常，且两组存在极显著差异（P＜0.01），说明气喘病组梅山猪的肾系统功能已经开始受到影响了。CK、LDH这2个指标是反映心机功能指标［17］，本研究中两组试验猪这2个指标都超出参考范围最大值，两组的LDH指标差异显著（P＜0.05），分析原因可能是梅山猪缺乏运动，偶尔运动或者应激会导致心机功能异常，同时，由于气喘病组梅山猪的气喘病，心脏加速跳动给机体其他的器官运输血氧，LDH指标和正常组的出现显著差异（P＜0.05）。另外，在试验研究中，Ca、P、Na、K、Cl等微量元素指标两组试验猪都正常，也没有显著差异（P＞0.05），表明两组试验猪生长发育正常，不存在营养方面的问题。

3.3 梅山猪的血清免疫指标分析

免疫指标是反映动物机体健康状态的重要指标，动物机体内血清中的抗体含量是动物健康与否的重要反映，机体内免疫因子的差异可以说明其表达分泌的分子通路存在差异［18］。IL-2、IL-4和IL-8是免疫因子，其差异是动物群体免疫力强弱的决定因素，类似的指标还有IFN-γ和TNF-α［19］。动物血液组织液等分泌液中存在一类具有抗体活性的球蛋白，这就是免疫球蛋白，免疫球蛋白有5种：IgA、IgG、IgD、IgE、IgM［20］。IgA能够抗病毒、中和毒素和其他抗原，具有广泛的免疫保护作用，是机体参与黏膜反应的主要效应因子［21］；IgM 是机体感染初期最早产生的抗体，在机体抗感染早期有着非常重要的作用［22］；IgG 主要是通过体液免疫阻止病原体抗原穿透过黏膜而进入动物机体组织致病［23］。所以本研究中主要检测IgA、IgG、IgM这3个抗体指标，来说明试验猪的抗病能力。补体（Complement， C） ，约占血清球蛋白总量的10%，是一类具有酶活性的动物机体内的免疫球蛋白［24］，机体首先要激活C3，后续才能连续激活其他补体；C4是当机体防御外源病菌侵入时通过免疫符合作用清除病原微生物［25］。本研究中，气喘病组梅山猪的IgA、IgG这2项指标均极显著低于正常组，说明其抗体水平极显著低于正常组，抵抗力相比正常组，严重下降。两组试验猪的IgM之间差异不显著（P＞0.05），说明气喘病组梅山猪染病已有一段时间，不是染病初期阶段。IL-2、IFN-γ这2项指标方面，两组试验猪之间出现显著差异（P＜0.05），也说明气喘病组梅山猪的免疫力比正常组梅山猪弱，这可能是由于肺炎支原体已经侵入梅山猪机体内。但是，两组试验猪的补体水平没有差异（P＞0.05），这点需要进一步深入研究，继续挖掘其内在机制。

4 结论

本试验通过对梅山猪气喘病的生理生化、免疫指标检测并分析发现，梅山猪气喘病在血液常规指标中的WBC、P-LCR、NEUT、NEUT%、RDWSD、LYMPH、HCT、MONO和LYMPH%，血清生化指标中的ALT、ALP、Urea、AST，脂肪代谢指标中的LDH以及免疫指标中的IgA、IgG、IL-2和IFN- γ等指标与正常梅山猪之间有极显著或者显著差异，筛选抗气喘病梅山猪可以重点参考并筛查以上这些指标相关的基因及其表达情况。