程金凤 王倩倩 甄萌萌 程艳丽

滨州医学院附属医院心血管内科，滨州 256600

昼夜节律是生物体在生理和行为上约24 h为周期的生理性节律，控制昼夜节律的系统称为生物钟（circadian clock）［1］。生物钟是生物在长期进化过程中形成的一种内源性适应机制，通过周期性的转录调节许多行为和生理功能，如睡眠-觉醒调节、血压、脂质代谢以及激素的分泌［2-3］。生物钟是由基因控制的，我们称之为生物钟基因（clock genes）［4］。Cry1作为其中一种主要的生物钟基因，对维持细胞稳态和细胞周期具有重要的作用，其表达异常可导致生物体昼夜节律发生紊乱。Cry1的表达紊乱与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生和发展具有一定关系。本综述结合最新研究进展阐述生物钟基因Cry1在AS中的作用，并探讨其可能的机制。

生物钟节律的分子机制

生物钟可分为中枢生物钟和外周生物钟，哺乳动物的中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核（SCN），外周生物钟存在于机体各组织细胞内。中枢生物钟将内源性的昼夜节律与外部太阳日同步，随后向外周生物钟发送同步信号，使机体在组织水平上保持一致的节奏［5］。核心钟基因和钟控基因统称为生物钟基因，核心钟基因主要有Clock和Bmal1（又称arnt1）、Per1/2/3、Cry1/2。钟控基因主要有Npas2、Rev-erbα、Hlf、Dbp、Tef、E4bp4、Stral3/dec1、Rorα、Ck1ɛ等。

生物钟作用的分子基础是转录-翻译负反馈环路，驱动时钟组件有节奏的表达。此环路由2个激活因子（Clock和Bmal1）和2个抑制因子（Per和Cry）驱动，还包括调节磷酸化的激酶和磷酸酶，从而定位和稳定这些时钟蛋白［1］。Clock与Bmal1的基因表达产物是具有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）-PAS结构域的转录因子，二者结合形成异源二聚体Clock/Bmal1，在转位到细胞核后，异源二聚体激活含有E-box顺式调控增强子序列的靶基因Per和Cry的转录，并在细胞质中翻译成Per和Cry蛋白，当Per和Cry蛋白积累达到一定浓度后，会形成稳定的Per/Cry异源二聚体从细胞质运输到细胞核，这些异源二聚体通过作用于Clock/Bmal1复合体抑制自身的转录，形成主要的负反馈回路。当Cry、Per mRNA和蛋白质的浓度降低，一旦Cry-Per复合物的核水平不足以实现自抑制，新的Per和Cry转录周期就会开始。此外，异源二聚体Clock/Bmal1也可激活Rev-erbα的转录，Rev-erbα蛋白通过竞争结合维甲酸相关孤儿受体反应元件（ROREs）的启动子，抑制Bmal1基因的转录，也可抑制Clock和Cry1基因的转录。因此，Bmal1可通过参与Rev-erbα的转录激活抑制自身转录。与Cry/Per复合物通过直接作用于Clock/Bmal1异源二聚体来抑制自身的表达不同，Rev-erbα通过抑制至少一种激活因子的转录来间接抑制自身的转录［6-8］。

生物钟基因Cry1与AS

AS是以脂质代谢障碍为基础的血管炎症性疾病，是大多数心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的潜在病理。虽然最近在治疗方面取得了一定的进展，但是AS及其并发症依然是老年人死亡最常见的原因［9］。血脂异常、肥胖、糖尿病、高血压和吸烟是已被证实的心血管危险因素，越来越多的研究表明昼夜节律的紊乱与CVD之间存在着显著关联［10］，Cry1基因的表达异常也影响着AS的发展。研究发现，与27例健康受试者（对照组）相比，招募的36例AS患者中Cry1 mRNA的表达显著降低，在人促使斑块形成的血管平滑肌细胞（VSMCs）中，包括Cry1在内的生物钟基因表达水平减弱，增强斑块破裂，影响AS的进程［11］。接下来从炎症、高血压、糖脂代谢方面探讨生物钟基因Cry1对AS发展产生的影响。

1、生物钟基因Cry1与炎症

AS是一种慢性炎症性疾病，伴有内皮功能障碍、泡沫细胞形成、血管平滑肌细胞增生等复杂病理变化［12］。研究显示，核心钟基因Cry1的表达可能是炎症过程的潜在影响因素［13］。Cry蛋白被证明是先天免疫和炎性反应的基本免疫调节成分。Cry1基因表达受损与血浆促炎细胞因子水平升高相关，如白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和 诱 导 型 一 氧 化 氮 合 酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）以细胞自主方式升高［8］。内皮功能障碍在CVD尤其是AS的发生发展中起着重要作用，是AS发展的早期发现和标志。核心钟基因Cry1通过调节睡眠剥夺过程中的炎症过程，在触发内皮功能障碍中发挥重要作用。睡眠剥夺小鼠模型中，Cry1的表达减少，血管内皮细胞中的促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）、黏附分子［如血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、细胞间黏附分子（ICAM）-1、E选择素（E-selectin）］表达增加，单核细胞与内皮细胞的结合增强，增加了AS的风险［13］。当在睡眠剥夺小鼠体内过表达Cry1后，促炎细胞因子和黏附分子的表达、单核细胞与内皮细胞的结合受到抑制，这意味着Cry1可能参与调节促炎细胞因子和趋化因子的表达。此外，过表达Cry1可以通过与腺苷酸环化酶相互作用抑制环磷酸腺苷（cAMP）的产生，Cry1蛋白的缺失减弱其对cAMP生成的抑制，导致cAMP水平升高和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活增加，随后通过S276位点p65的磷酸化导致核因子（NF）-κB激活［8］。Qin与Deng［13］通过Western blot检测睡眠剥夺小鼠主动脉内皮细胞中p65的磷酸化状态，与对照组相比，睡眠剥夺组小鼠内皮细胞中p65的磷酸化水平显著上调，而这一结果可被Cry1过表达显著抑制。本实验萤光素酶报告实验结果进一步显示，过表达Cry1显著抑制NF-κB在内皮细胞中的活化。此外，过表达Cry1显著降低Toll样受体（TLR）2、TLR4蛋白的表达［14］。综上所述，Cry1可以通过调控TLR/NF-κB通路缓解AS的发展。

2、生物钟基因Cry1与高血压

昼夜节律紊乱可导致醛固酮、肾素、血管紧张素Ⅱ和糖皮质激素等激素分泌的变化，这些激素在一定程度上与血压的日常调节节律有关。血压的变化取决于内源性和外源性因素。内部因素包括自主神经活动和体液因素（皮质醇、肾素、血管活性肠肽和醛固酮）。外部因素包括身体的活动、饮食、情绪状态和睡眠/清醒状态［2］。血压的一个显著特征是它的昼夜节律性，从黎明开始升高，中午达到峰值，下午下降，达到最小值［15］。健康人的夜间血压会下降10%～20%。静息血压变化不超过10%的人被称为“非杓型血压”。盐敏感性高血压和非杓型高血压可增加CVD的死亡风险［2］。

近年来的研究表明，昼夜节律机制在血压调节中发挥着重要作用。高血压组的小鼠Cry1水平明显低于正常血压组［2］。Doi等［16］在Cry1/Cry2基因敲除小鼠中研究了血压，与对照组小鼠相比，Cry1-/2-小鼠的血压昼夜变化特征消失，血浆醛固酮水平显著升高，表现出盐敏感性高血压，使用选择性醛固酮受体拮抗剂依普利酮，盐敏感性高血压表型可以得到改善［17］。3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）被认为是醛固酮合成过程中的一个限速步骤，在对导致Cry1-/2-小鼠肾上腺功能障碍的生成酶的研究中，发现了Hsd3b6是Cry基因失活导致小鼠盐敏感性高血压的关键酶。Hsd3b6是3β-HSD的一个亚型，仅在肾上腺球状带细胞中表达。在Cry1-/2-小鼠肾上腺中，Hsd3b6 mRNA水平升高，3β-HSD酶活性增强，使血浆醛固酮水平升高。人类Hsd3b1基因与小鼠Hsd3b6基因在功能上是对应的，因为Hsd3b1在人类肾上腺醛固酮生成细胞中表达［15-16］。

高血压导致心血管事件的发生，其病理基础是其供应血管发生动脉僵硬、AS、狭窄和闭塞［18］。因此早期诊断治疗高血压对治疗AS病变有着重要作用。而血压昼夜节律的紊乱会影响高血压的预后，临床指南也强调了将血压维持在正常水平的重要性，因为严格控制血压与降低主要心血管事件和死亡风险有着很强的相关性［19］。

3、生物钟基因Cry1与脂代谢

AS是一种脂质来源的炎症性疾病，涉及多细胞改变，以脂质斑块形成为特征［12］。脂质是细胞膜和脂蛋白的组成成分，其作为细胞内、外的信号分子对细胞生理方面有着广泛的影响。脂质代谢中有很多关键的转录调节因子，包括Rev-erb、ROR蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、PPARγ和PPARδ等。这些转录调节因子存在于肝脏、脂肪组织中，受到生物钟的调控，并呈现昼夜节律表达，当昼夜节律障碍时，导致脂质代谢紊乱、肥胖和代谢疾病［20］。大量文献表明，生物钟基因影响脂质代谢关键限速酶、转运蛋白和激素等表达，参与机体脂代谢反应调控，维持动物体内脂质平衡，防止脂肪过多堆积，这提示生物钟在脂类代谢中有着重要的潜在功能。Ando等［21］的研究发现，ob/ob小鼠在代谢异常出现之前，脂肪组织中Cry1等生物钟基因的表达就已经表现出降低现象，提示生物钟基因表达异常先于脂肪代谢紊乱。Barclay等［22］的研究表明，Cry基因的缺失会增加饮食引起的肥胖症易感性，高脂饮食的Cry1-/2-小鼠显示出与脂肪摄取和生成相关基因FASN、ACC1、LPL、DGAT1的上调，出现脂质蓄积。此外，有研究表明，与高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠相比，过表达Cry1的ApoE-/-小鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度均有所下降，小鼠主动脉窦斑块面积减小［14］。ChREBP-α可驱动脂肪生成，从而导致肝脏脂肪变性的发生，最近的研究显示，Cry1通过结合ChREBP-α的c-末端基序和降低ChREBP-α全长蛋白的丰度来促进ChREBP-α的降解，抑制脂肪生成［23］。综上，Cry1可通过降低血脂水平延缓AS的进展。

4、生物钟基因Cry1与糖代谢

高血糖是微血管并发症的主要危险因素，其与动脉内膜中层厚度存在因果关联，因此早期血糖控制可以降低心血管事件的发生。高血糖与血脂异常在AS形成中的作用密切相关，高血糖可加重血脂异常，也可对AS有独立影响。许多研究表明，链脲霉素诱导的高血糖不伴脂质或脂蛋白异常，其可以促进ApoE-/-小鼠发生AS［24］。Veerman等［24］的研究表明糖尿病微血管病变可加快ApoE-/-糖尿病小鼠AS的发生和发展。

肝脏是哺乳动物主要的糖异生器官，与其他器官一起参与维持体内血糖水平的平衡［25］。生物钟通过同步组织特异性的葡萄糖代谢机制维持血糖的生理水平［26］。Cry基因缺陷小鼠显著降低糖异生基因的表达抑制，并使地塞米松诱导的基因表达水平升高，这表明Cry基因对糖皮质激素受体和糖异生基因转录有着显著的抑制作用。此外，Cry1和/或Cry2基因缺失的小鼠出现了糖耐量下降、血液循环中皮质醇浓度升高的表现，提示Cry可能通过降低对下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制，增加糖皮质激素在肝脏中的转化激活［27］。Zhang等［27］的实验研究发现，禁食期间肝脏Creb的活动可由Cry1基因调节，它们在肝脏中有节律地表达。Cry1的表达在白-夜过渡期间升高，它能通过阻断胰高血糖素介导的细胞内cAMP浓度的增加和PKA介导的环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMPresponse element-binding protein，Creb）磷酸化降低空腹糖异生基因的表达，如葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶-1（Pck1），最终降低血糖水平。研究显示，与对照组相比，Cry基因敲除小鼠中糖异生基因的mRNA水平更高，而过表达Cry1下调了空腹注射胰高血糖素小鼠的糖异生基因表达，还降低了胰岛素抵抗小鼠的血糖浓度并改善了胰岛素敏感性［28］。另外，空腹或胰高血糖素诱导的cAMP浓度以24 h为周期波动，其波谷水平与Cry蛋白表达的峰值水平一致。Cry蛋白可能通过与G蛋白Gsα亚基的相互作用调节肝脏糖异生的昼夜变化，导致胰高血糖素触发Creb磷酸化［29-30］。FOXO1（forkhead box O1）是糖异生关键酶G6pc、Pck1的正向调节剂，而Cry蛋白可以促进FOXO1的降解，从而抑制糖异生［31］。由此可以得知，肝脏中Cry1基因表达量的升高可以抑制cAMP的累积和Creb磷酸化的发生，进而抑制肝脏细胞中葡萄糖的浓度，降低患2型糖尿病的风险。

小结

越来越多的研究表明，昼夜节律紊乱已经成为AS形成和发展的危险因素，其中生物钟基因Cry1是昼夜节律的一个重要组成部分，但是我们对Cry1作用机制的认识仍然有限。通过对近几年的研究分析我们发现，生物钟基因Cry1可以通过调节机体的炎症、血压、糖脂代谢以及内皮细胞功能来影响AS的进展。接下来我们需要进一步探索生物钟基因，特别是Cry1基因，是通过何种机制来影响AS的发生发展。相信随着对生物钟基因研究的进一步深入，将会为我们寻找AS相关性疾病新的预防和治疗靶点提供更充足的理论基础。