宋沛颖，李慧勇，那微，笔雪艳，肖宇

(1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036；2.黑龙江省药品检验研究院，黑龙江 哈尔滨 150088；3.国家药品监督管理局中药质量研究与评价重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150088；4.黑龙江省中药质量研究与评价重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150088)

安神宁为中药糖浆剂，由刺五加浸膏、灵芝、五味子制备而成，其中灵芝、五味子粉碎成粗粉后加60%乙醇浸渍压榨，压榨液加刺五加浸膏搅匀制备而成，具扶正固本、益气健脾、补肾安神作用，主要用于神经衰弱、食欲不振、全身无力等。处方中五味子为木兰科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果实，具收敛固涩、益气生津、补肾宁心作用[1]。其中木脂素类成分在五味子果实中含量较高，也是发挥五味子多种功效的有效成分，主要含有五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子醇甲、五味子醇乙等[2-5]。

在中药、天然药物等复杂体系的成分分析和质量评价工作中，应用传统外标法对产品含量进行测定，对照物质使用量大且品类繁多，部分对照物质稳定性较差，对照品制备成本高，技术操作难度大，质量监控过程烦琐，对产品进行多指标整体控制，逐渐成为产品质量控制的研究方向[6-7]。本研究应用外标法同时测定安神宁中4个木脂素含量，同时建立以五味子醇甲为内参物，确定五味子醇甲与五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素之间的相对校正因子，计算各成分的含量的一测多评方法，可用于安神宁的质量控制[8-12]。

1 仪器与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Thermo Evolution 201紫外-可见分光光度计(Thermo公司)；超声波清洗仪AS10200A(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；AE240电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Laborota 4001旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。

Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色谱柱；五味子醇甲对照品(批号：110857-201714，含量99.9%)、五味子甲素对照品(批号：110764-201714，含量99.3%)、五味子乙素对照品(批号：110765-200710，纯度>98%)均购于中国食品药品检定研究院；五味子醇乙对照品(批号：32120010，纯度>98%)来自上海安谱实验科技股份有限公司；研究用10批安神宁样品由黑龙江双兰星制药有限公司(国药准字Z23020211)提供；乙腈、甲醇为色谱纯(Honeywell公司)，其余试剂为分析纯(国药集团化学试剂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 检测波长确定 取4种对照品适量，制成每1 mL各含0.05 mg的混合对照品溶液，以Thermo Evolution 201紫外-可见分光光度计、岛津LC-2010A高效液相色谱仪(DAD检测器)在190～400 nm范围内进行波长扫描，4种木脂素混合溶液在217 nm处有最大吸收。

2.1.2 流动相组成及洗脱程序[13-15]乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱程序：0～10 min，20% A→60% A；10～25 min，60% A；25～35 min，60% A→75% A；35～45 min，75% A→80% A；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲30 μg、五味子醇乙10 μg、五味子甲素10 μg、五味子乙素10 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密量取供试品溶液10 mL，至25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理5 min，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 测定方法

2.3.1 专属性试验 按处方比例、工艺制备缺五味子药材的阴性样品，按“2.2.2”项供试品溶液制备阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进入液相色谱仪进行分析，结果阴性对照色谱图中，在五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对照品溶液和供试品溶液色谱图相应的保留时间处无色谱峰出现，五味子醇甲色谱峰相邻处虽有一小色谱峰可能对样品产生干扰，但其面积小于样品中五味子醇甲峰面积的5%，符合《中国药典》2020年版要求[1](见图1)。

A.对照品；B.供试品；C.阴性样品

2.3.2 线性关系考察 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，精密称定，配制系列浓度对照品混合溶液，进入液相色谱仪进行分析，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的线性回归方程及相关系数，结果4种成分线性关系良好，结果见表1。

表1 线性关系考察(n=8)

2.3.3 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素RSD分别为0.1%、0.1%、0.3%、0.2%，精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取安神宁样品(批号：150901)，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进入液相色谱仪进行分析，计算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的平均含量及RSD分别为：五味子醇甲0.083 2 mg·mL-1(RSD=0.5%)、五味子醇乙0.020 0 mg·mL-1(RSD=1.7%)、五味子甲素0.010 4 mg·mL-1(RSD=1.3%)、五味子乙素0.013 0 mg·mL-1(RSD=1.5%)，重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、1、3、6、10、15、21、28 h按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积RSD分别为 0.3%、0.2%、1.0%、0.3%，稳定性良好。

2.3.6 加样回收率 精密称取已知含量安神宁样品5 mL(批号：150901，含量见重复性试验结果)，精密加入已知浓度的对照品混合溶液，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进入液相色谱仪进行分析，结果加样回收率分别为五味子醇甲98.52%(RSD=0.8%)、五味子醇乙103.43%(RSD=1.4%)、五味子甲素109.69%(RSD=0.9%)、五味子乙素107.92%(RSD=1.7%)，准确性良好(见表2)。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

2.3.7 耐用性试验 使用Agilent 1100液相色谱仪，分别选用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色谱柱进行分析；使用Waters e2695液相色谱仪，Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色谱柱在进行分析，测定结果五味子醇甲平均含量0.086 7 mg·mL-1(RSD=0.9%)、五味子醇乙0.021 4 mg·mL-1(RSD=1.5%)、五味子甲素0.016 7 mg·mL-1(RSD=1.9%)、五味子乙素0.019 7 mg·mL-1(RSD=1.7%)，耐用性良好。

2.4 相对校正因子的计算

2.4.2 相对校正因子耐用性考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液5 μL，平行进样2次，以五味子醇甲为内参物，考察不同液相色谱仪、不同色谱柱五味子醇甲对其他3个成分的相对校正因子(RCF)值，结果耐用性良好(见表3)。

表3 相对校正因子耐用性考察

2.4.3 相对保留时间RT考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液5 μL，平行进样2次，以五味子醇甲为内参物，考察不同液相色谱仪、不同液相色谱柱五味子醇甲对其他3个成分的相对保留时间，结果3个木脂素成分相对保留时间平均值分别为RT五味子醇乙=1.118(RSD=1.0%)、RT五味子甲素=2.349(RSD=1.9%)、RT五味子乙素=2.603(RSD=2.2%)，其相对保留时间应在规定值的±5%范围之内。

2.4.4 一测多评法与外标法含量测定结果比较 取安神宁样品共10批，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进入液相色谱仪进行分析，应用外标法(EMS)及本研究建立的一测多评方法(QAMS)对同一供试品溶液同时测定，结果两者测定含量结果基本一致，一测多评方法可用于该品种的含量测定(见表4)。

表4 样品含量测定结果(mg·mL-1)

3 讨论

3.1 检测波长的确定 本试验确定检验波长试验，取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素对照品制成每1 mL各含0.05 mg的混合对照品溶液，使用Thermo Evolution 201紫外-可见分光光度计，在190～400 nm范围内扫描，混合对照物质溶液于217 nm处有最大吸收；用岛津LC-2010A高效液相色谱仪DAD检测器测定最大吸收，五味子醇甲、五味子醇乙在λ=216 nm、五味子甲素在λ=214 nm处、五味子乙素在λ=215 nm处有最大吸收，综合上述，本试验选择217 nm作为测定波长。

3.2 流动相确定 本试验应用甲醇-水、乙腈-水[16-17]两套系统对样品进行分析测定，结果甲醇-水系统虽然能达到较好的分离效果，但是基线漂移幅度大，分离色谱峰的峰面积波动大，而乙腈-水系统基线平稳，样品分离度好。

3.3 溶液稳定性 稳定性试验过程中发现，4个木质素类成分24 h内稳定性好良好，色谱峰面积稳定；继续监测稳定性，除五味子醇甲峰面积基本保持稳定外，其余3种木质素峰面积均发生改变。同时，五味子醇甲在五味子中含量较大，有指征性。综上，故本方法选择五味子醇甲为一测多评内参物。