高 铭，陈瑞战，吴 静，白春龙，孙 惠，李冬雪，吴文静

(长春师范大学化学学院，吉林 长春 130032)

多糖是由单糖通过糖苷键连接而成的高分子聚合物，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，常与蛋白质结合参与细胞的调节和分化，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌[1]、免疫调节、降血糖、降血脂[2]、抗病毒[3]、抗疲劳[4]、抗炎、神经保护等药理活性[5]，几乎没有毒副作用，这使得它具有非常大的潜力，应用于药品、功能食品、化妆品、饮料等领域。但多糖常与蛋白质、脂质、花青素等化合物结合，导致提取效率低、分离纯化难，且易引起结构变化[6]。此外，不同的提取技术和工艺参数不仅会影响多糖的得率，还会引起多糖理化性质的改变和生物活性的降低。因此，比较不同提取工艺对柠檬多糖(LPs)得率、理化性质的影响对该多糖的开发利用具有极为重要的意义。

柠檬(CitruslimonL.)为双子叶芸香科柑橘属常绿小乔木植物的果实，是药食两用水果。柠檬中富含果胶多糖、柠檬酸、橙皮苷、维生素、花青素等活性成分，具有抗氧化、抗癌[7]、抗炎[8]、抗增殖、抗菌、抗糖尿病和抗病毒等活性，广泛应用于冰糕、饮料、果酱、果冻、糖果等生产[9]。

本研究采用六种不同工艺提取LPs，并通过DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换和Sephadex G-150凝胶柱层析分离和纯化多糖组分。利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、紫外可见光谱(UV)等比较多糖的理化性质，为该多糖在医药、功能食品、化妆品等领域的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬产自中国四川省资阳市安岳县，经过60℃减压干燥，粉碎，石油醚回流脱脂和脱色，乙醇(φ=95%)回流去除小分子，风干得到预处理样品。

N-1100旋转蒸发仪(日本爱郎仪器有限公司)；X1R高速离心机(德国Heraeus Multifuge)；FD-1E-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 多糖的提取及分离

LPs的提取、分离、纯化工艺流程如图1所示。

图1 LPs的提取、分离、纯化工艺流程

1.2.1 热回流提取(HRE)

准确称取2 g预处理样品，加入180 mL蒸馏水，在80℃的条件下提取2.5 h。提取物在转速5 000 r/min离心20 min，上清液于50℃下减压浓缩至原体积的1/5，加入4倍体积的95%乙醇，在4℃条件下醇沉12 h；混合物在5 000 r/min离心15 min，收集沉淀用蒸馏水溶解，Sevage法脱蛋白，用分子量3 500 Da的透析袋流水透析36 h，冷冻干燥得到HRE多糖(LPHR)。

1.2.2 超声辅助提取(UAE)

采用SL-2010N超声装置(南京顺流仪器有限公司)，在频率为20 kHz、温度45℃、蒸馏水与预处理样品比为80 mL/g、超声功率675 W、超声时间40 min条件下超声提取。提取后离心、浓缩、醇沉、脱蛋白和透析步骤与HRE相同，冻干得到UAE多糖(LPUA)。

1.2.3 微波辅助提取(MAE)

采用MAS-I 微波提取仪(上海新仪微波化学科技有限公司)，按提取温度70℃、液料比60 mL/g，微波功率200 W、提取50 min条件进行微波提取。提取混合物后处理方法与HRE相同，冻干得到MAE多糖(LPMA)。

1.2.4 复合酶辅助提取(EAE)

本项目使用的混凝土平仓推土机有两类，分别为D31p-18A和D65P-8，二者均产自日本；所使用的仓面碾压设备有三类，包括BW200、BW202AD和BW75S，三者均产自德国。检测设备有DN-40中子仪和TS-600VC值测量仪。

干燥的预处理样品2 g，加入140 mL复合酶溶液(果胶酶(w=0.2%)、纤维素酶(w=0.2%)、木瓜蛋白酶(w=0.1%)，pH为4.5)、25℃条件下浸泡12 h，然后在60℃下复合酶辅助提取2 h。复合酶灭活后(100℃、灭活10 min)，提取混合物后处理方法与HRE相同，冻干得到EAE多糖(LPEA)。

1.2.5 复合酶辅助超声提取(UEE)

干燥的预处理样品2 g，加入140 mL复合酶溶液(w=0.5%)(果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶的活性比为2∶2∶1，pH为4.5)，于25℃浸泡12 h。随后，使用SL-2010N超声装置，在超声功率375 W、温度40℃、超声时间40 min、频率20 kHz进行提取。提取混合物在100℃下灭活复合酶10 min，得到的溶液处理方法与HRE相同，真空冷冻干燥得到UEE多糖(LPUE)。

1.2.6 复合酶辅助微波提取(MEE)

干燥的预处理样品2 g，加入140 mL复合酶溶液(w=0.5%)(果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶的活性比为2∶2∶1，pH为4.5)，在25℃下浸泡12 h。然后使用MAS-I微波提取仪(微波功率400 W、温度50℃、提取时间40 min)进行复合酶辅助微波提取。提取混合物酶灭活后，提取液与HRE处理相同，冷冻干燥得到MEE多糖(LPME)。

1.3 LPs的分离纯化

将50 mg LPUE和LPME溶于50 mL蒸馏水中，过0.45 μm滤膜。滤液加入DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱(2.5 cm×50 cm)，用 0、0.5、1 mol/L NaCl梯度洗脱，流速0.5 mL/min。洗脱液用全自动收集器(5 mL/管)收集。用苯酚-硫酸法在490 nm处测定各管中吸光度值，绘制出吸光度值与管数的洗脱曲线。将每个主要峰的洗脱液汇集、透析、浓缩后上Sephadex G-150柱(1.5 cm×50 cm)进一步纯化，洗脱液为0.1 mol/L NH4HCO3、流速0.6 mL/min，收集洗脱液，测定吸光度值，绘制洗脱曲线，合并主要峰洗脱液、使用透析袋(8 000～14 000 Da)透析、冻干，得到四个纯化多糖组分(LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2)。

1.4 LPs的理化特征分析

1.4.1 LPs的化学成分分析

采用苯酚-硫酸法(Glc为标准品)[10]、考马斯亮蓝法(牛血清白蛋白为标准品)[11]、硫酸-卡唑法(葡萄糖醛酸为标准品)[12]、亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法(芦丁为标准品)[13]、福林-乔卡尔法(没食子酸为标准品)[14]，测定LPs中糖、蛋白质、糖醛酸、总黄酮和多酚含量。

将干样品(1 mg)研磨并与干KBr(100 mg)混合，压成薄膜，使用iS50 FT-IR分光光度计(美国Thermo公司)在4 000～400 cm-1范围内检测。样品(1 mg/mL)的紫外光谱用Cary 60紫外可见分光光度计(美国安捷伦)在200～400 nm波长范围内检测。

2 结果与讨论

2.1 提取方法对LPs得率的影响

六种不同的提取工艺提取LPs，各工艺的得率和工艺参数见表1，LPs的得率按HRE、MAE、UAE、EAE、MEE、UEE的顺序增高。HRE是最传统的提取方法，主要依靠较高的温度来提高LPs的溶解和传质速率、增加溶剂的扩散速率，从而达到提高LPs得率的目的。根据单因素实验结果，在液料比为90 mL/g、提取时间150 min、提取温度80℃的条件下，LPHR的得率为(4.20±1.18)%。

EAE是一种新型有效的提取技术，通过对细胞壁的解聚， 提高生物活性化合物的可提取性[15]。但由于天然植物材料的独特性质，适宜的水解酶的种类和配比各不相同，需要优化考察。首先通过正交实验确定复合酶的适宜配比，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的活性比为10∶30∶3。在该复合酶配比和表1给出的最佳EAE条件下，LPEA的提取率为(12.70±1.05)%，是LPHR的3.02倍，表明EAE能够有效提高多糖得率[16]。

表1 不同提取工艺和参数对LPs的影响

LPUA的得率和UAE条件见表1。UAE提取的LPUA得率(8.82±1.04)%是HRE的2.1倍。这一结果证明，UAE在最佳条件下可以显著提高LPUA的得率，这主要是由于超声波可以导致细胞壁破裂，增加多糖的溶解和传质，从而提高多糖得率[17]。然而，当这些参数超过表1给出的范围时，可能会导致多糖降解，从而导致得率下降。这种现象可能是由于糖苷键断裂，导致多糖的物理化学和功能特性发生一系列变化，证明UAE也是一种有用的多糖提取和修饰方法，最佳的工艺参数需要优化。

通过正交实验确定的MAE工艺条件为液料比60 mL/g、提取时间50 min、提取温度70℃、微波功率200 W，可使LPMA得率达到(6.27±1.16)%。在此条件下，LPMA的得率比LPHR提高了49.29%，其原因可能是微波辐射导致植物细胞壁基质疏松甚至破裂，增加了溶剂的渗透扩散速度，促进了多糖的溶解扩散，提高了LPMA得率[18]。

在上述实验的基础上，通过单因素和响应面优化实验进一步探讨复合酶与UEE和MEE的协同作用。在复合酶(w=0.5%)(纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的活性比为10∶30∶3)、复合酶溶液与原料比为70 mL/g、超声时间40 min、超声温度40℃、超声功率375 W时，LPUE的提取率最高(14.41±1.21)%。复合酶(w=0.5%)(纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的活性比为10∶30∶3)、复合酶溶液与原料比70 mL/g、微波时间40 min、提取温度50℃、微波功率300 W时，LPME的提取率最高(13.46±1.53)%。与单一EAE、UAE和MAE相比，UEE和MEE均能提高产率，说明复合酶与超声、微波组合具有显著的协同作用。这可能是由于超声波和微波破坏细胞壁，加速细胞内多糖的释放，并参与调节复合酶活性，使多糖得率大幅提高，这与LARSEN等[19]报道的在某些实验条件下，超声和酶的联合应用可以增加植物多糖的提取并促进聚合物的降解的结果一致，说明超声、微波和复合酶联合使用不仅能提高多糖的提取率，还能调节多糖的理化特性和功能特性，是高效提取和修饰植物多糖的有效方法。

2.2 LPUE和LPME的纯化

提取后，采用DEAE-Sepharose CL-6B色谱柱对LPUE和LPME进行分离纯化。如图2(a)所示，用H2O和0.5 mol/L NaCl溶液洗脱分离出两个组分，分别命名为LPUE-1s和LPUE-2s。LPME的洗脱曲线如图2(b)所示，得到两个主要组分(LPME-1s和LPME-2s)，其中LPME-2s为主要组分，表明LPME中包含两种多糖。上述四个组分上Sephadex G-150凝胶柱进一步纯化，得到LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2四个纯化多糖，其得率分别为(23.14±1.58)%、(14.70±1.08)%、(22.14±11.67)%和(23.25±2.01)%(表2)。

(a) (b)图2 LPUE、LPME在CL-6B凝胶柱上的洗脱曲线

2.3 LPs的理化性质

不同的提取工艺可能导致分子链水解断裂和分子间氢键断裂，从而改变多糖的理化性质和生物活性[20]。LPs的理化性质测定结果见表2，表明不同提取工艺得到的粗多糖理化性质存在明显差异。LPHR、LPEA、LPUA、LPUE、LPMA和LPME的PC分别为(2.32±0.22)%、(1.91±0.16)%、(2.24±0.20)%、(2.29±0.78)%、(2.01±0.15)%和(1.88±0.16)%，说明这些LPs均含有一定量的蛋白质。HRE的PC最高，MEE最低，LPHR的PC值比LPME提高了23.4%。与此同时，LPEA的PC值低于其他四种样品，说明复合酶水解比其他方法能更有效降低提取多糖的PC值，这可能是由于蛋白质在酶解过程中的降解，而微波通过微波场与偶极子分子和离子的分子相互作用，可以迅速提高组织细胞内部的温度和压力，使组织破裂，溶解内部成分。在这一过程中，还可能引起生物大分子(如蛋白质和多糖)的降解，这些综合效应可能导致LPME的PC降低。LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2中PC含量分别为(1.43±0.09)% 、(1.06±0.05)%、(1.19±0.07)%和(0.93±0.04)%，说明四种纯化多糖中也含有一定量的蛋白质，但其含量明显低于其粗多糖。这一结果表明，在Sevage法脱蛋白过程中，纯化多糖中部分游离蛋白被去除，而剩余的蛋白质可能通过共价键或非共价键与多糖形成稳定的复合物[21]。

表2 不同工艺提取柠檬多糖的理化性质

LPs的UAC按照LPME(31.89±2.21)%>LPUE(27.37±2.08)%>LPEA(25.88±1.06)%>LPMA(19.66±1.14)%>LPHR(19.16±1.22)%>LPUA(18.71±1.04)%的顺序递减，说明不同提取方法提取的UAC存在显著差异。在所有提取的LPs中，LPME的UAC最高，证明微波和复合酶的协同作用可以提高多糖中的UAC，这可能是因为微波辐射会增加偶极子旋转，导致热量快速产生，使细胞破裂，诱导聚半乳糖酸链水解，UAC增加。同时LPUE和LPME的纯化多糖的LPUE-1和LPME-1明显高于其粗多糖，这可能是纯化后多糖的纯度增加以及多糖结构差异所致；同样，MEE提取的纯化多糖的UAC略高于UEE提取的纯化多糖，这与两种提取方法得到的粗多糖一致。

LPs中的TFC和TPC分别在(0.45±0.03)%～(1.46±0.13)%和(0.14±0.01)%～(0.42±0.04)%，表明不同提取方法的LPs及纯化多糖均含有一定数量的黄酮类和多酚类物质。LPME的TFC和TPC最高，分别为(1.46±0.13)%和(0.42±0.04)%，说明MEE可有效增加LPME的TFC和TPC。这可能是由于在微波萃取过程中，微波萃取器内腔温度和压力的迅速升高破坏了物质细胞，将内部的黄酮和多酚释放到提取溶剂中，提高了LPs的TFC和TPC。

但纯化多糖中的类黄酮和多酚含量明显低于粗多糖，这可能与多糖在乙醇沉淀、透析等纯化过程中游离类黄酮和多酚被去除有关。特别是LPUE-1和LPUE-2中较低的TPC也可能是由于高强度超声对多酚结构的破坏。但从表2可以看出，四种纯化多糖中仍含有一定数量的类黄酮和多酚，这可能是由于这些化合物与多糖形成了稳定的复合物，这与报道的结果[21]一致。上述结果表明，选择合适的提取方法和工艺参数不仅可以提高多糖的得率，而且还可以改善其理化性质，从而导致其功能特性的变化。

2.4 FT-IR光谱分析

傅里叶变换红外光谱(FT-IR)是表征多糖中有机基团的有力工具。FT-IR光谱(图3)显示，四种纯化多糖均有强而宽的吸收峰，这是由于羧酸的游离/键合羟基的分子内或分子间氢键的O—H伸缩振动，表明 LPUE和LPME中存在—OH[22]。四种多糖均未发现新的结构峰，表明在分离纯化过程中未产生新的官能团[23]。纯化多糖的FT-IR光谱在3 300～3 500 cm-1之间显示出宽范围的强吸收区，表明PMP结构中存在—OH[24]，该吸收峰与羧酸的游离/键合羟基的分子间和分子内氢键的振动模式有关[25]。2 920 cm-1左右是甲基或亚甲基的C—H伸缩振动，是多糖的特征吸收峰[26]。在1 739 cm-1和1 651 cm-1处的两个吸收峰分别表示酯羰基(C═O)基团和羧酸根离子伸缩带(COO-)，表明柠檬多糖中存在羰基[27]。由于1 739 cm-1处的吸光度高于1 651 cm-1处的吸光度，这是低甲氧基果胶多糖的特征[27]。1 739 cm-1附近的吸收表明存在糖醛酸[28]。LPUE-1和LPME-1中糖醛酸含量相近，LPME-2中约1 730 cm-1处的峰略高于LPUE-2，说明LPME-2中糖醛酸含量高于LPUE-2，这与UAC测定结果一致。此外，蛋白质氨基带也可能在1 636 cm-1处出现吸收，表明LPs中存在蛋白质[29]。1 413 cm-1是C—H剪切振动的特征吸收峰[30]。而622 cm-1处的吸收峰为O—H的伸缩振动，揭示了LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2中酚类化合物的存在[31]。UEE和MEE处理并未改变LPs在3 400 cm-1、2 920 cm-1和1 621 cm-1附近的主要吸收峰[32]。结果表明，超声波处理对糖苷键和糖环的结构没有明显影响，但不同提取方法所得产物的峰强存在一定差异，说明不同工艺会影响多糖中的PC、UAC。

A—LPUE-2，B— LPUE-1，C—LPME-2，D—LPME-1图3 LPUE-1、LPME-1、LPUE-2和LPME-2的FT-IR光谱

2.5 紫外光谱分析

用紫外分光光度计测量260～280 nm处的吸收峰，以确定样品是否含有蛋白质[33]。研究表明，不仅芳香族氨基酸或蛋白质在250～290 nm处有吸收峰，带有羰基的化合物在280 nm附近也有弱吸收[34-35]。四种柠檬多糖的紫外可见光谱见图4。最大紫外吸收值在200 nm处，证明多糖的紫外吸收处于末端，在260～280 nm附近有吸收峰，说明多糖含有蛋白质、多酚和糖醛酸(表2)。如图4所示，LPUE-2和LPME-2在260 nm附近没有明显的峰，说明两种LPs的蛋白质含量较低。图中LPUE-1的吸收峰明显高于其他三种纯化多糖，说明超声波在UV-Vis光谱中，280 nm附近的LPUE-1吸收强度增加[36]。四种多糖经分离纯化后仍含有一定量的蛋白质，其原因可能是蛋白质与多糖形成稳定的复合物，这些复合物的形成可能会影响其生物活性[37]。

(a)LPUE-1

(b)LPUE-2

(c)LPME-1

(d)LPME-2

3 结论

不同的提取工艺对LPs得率和理化特征有显著影响。UEE和MEE的多糖LPUE和LPME得率、UAC、TPC和TFC均高于其他工艺得到的LPs组分。分离、纯化后四种LPs多糖组分的PC、TPC和TFC均低于分离前的LPs多糖组分。紫外光谱分析表明LPUE-1和LPME-1的蛋白质含量高于其LPUE-2和LPME-2。红外光谱证明所有多糖官能团都具有多糖的一般特征吸收峰。研究表明，UEE和MEE是两种高效的植物多糖提取和改性技术。LPs结构和功能特性有待进一步研究。