黄乐，邓月萍，孙雅晨，刘春兰，刘丽华

（厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361102）

自然水体中的硒主要为无机（硒酸盐、亚硒酸盐）形态[1]。硒元素是自然界中的痕量元素，在未被污染的水体中，硒质量浓度一般为0.01～0.20 μg/L[2]。无机硒可由消化道吸收，为细胞内硒代半胱氨酸的合成提供原料[3]。硒也是人体必需的微量元素之一，主要的生物学效应是抗氧化性[4]，能够提高机体免疫力[4]，防治心脑血管疾病[5-6]，并具有抗癌[5]等功效。机体摄入的硒元素通过维持含硒酶的活性，保护大脑免受过氧化损伤[7]，预防病毒感染，增强免疫功能[8]，抑制重金属毒理[3]。但摄入量过高也会对人体造成毒害[9]，如加大患克山病的风险[10]。因此，不少学者[11-12]根据相关资料，为富硒食品含硒量设定合理的范围：下限保证补硒有效性，免于患上硒缺乏的疾病；上限考虑食用安全性，避免摄入过多而影响自身健康。

富硒水产是近年来开发补硒产品的一个新尝试。黄蚬（Corbicula aurea Heude）隶属于真瓣鳃目，蚬科，蚬属，是典型的滤食性底栖生物，是常见的经济水产品种，属于大众消费品，具有较强的推广潜力。贝类通过通气作用富硒，富硒能力因硒元素形态而异。黄蚬在添加亚硒酸钠、硒酸钠、硒代蛋氨酸（50和500 μg/L）的环境中暴露3 d，分别引起通气活动的加强、减弱和无改变[13]；在2 000 μg/L亚硒酸钠环境中暴露1 h，富硒转运仍未饱和，而在约1 000 μg/L硒酸钠、100 μg/L硒代蛋氨酸的相似条件下即饱和[2]。

现设置不同浓度的无机硒加富培养环境，采用原子荧光光谱法测定黄蚬体内的硒含量，分析环境无机硒浓度对黄蚬体内总硒含量的影响，初步探讨黄蚬对无机硒的富集作用以及达到硒饱和的条件，并按照中国营养学会提供的膳食标准，评估富硒黄蚬的膳食摄入量，为补硒食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

2018年6月，鲜活黄蚬购自厦门市镇海路市场，平均个体质量6.643 g，运回实验室暂养2 h后，加富培养。

1.1.2 质控样

扇贝粉成分分析标准物质（GBW 10024，地球物理地球化学勘查研究所），含硒体积分数为（1.5±0.3）×10-6。

1.1.3 试剂等

硝酸（HNO3）和过氧化氢（H2O2，30%）超级纯；硒单元素溶液标准物质[GBW(E)080215]，100 mg/L，批号为17073（中国计量科学研究院）；亚硒酸钠（Na2SeO3）、盐酸（HCl，10%和50%）、铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）、硼氢化钾（KBH4）、氢氧化钠（NaOH）分析纯。分析测定用水为超纯水。

1.1.4 仪器设备

AFS-610B原子荧光光谱仪（北京瑞丽仪器公司）；硒编码空心阴极灯；微波消解仪（美国CEM公司，型号MAES5）；超纯水仪（美国Millipore公司，型号Elix-5+milli-Q）；电子天平（德国Sartorius公司，型号BS224S,BSA822）、电热板（意大利Lab Tech公司，型号EH20B）。

1.2 方法

1.2.1 黄蚬培养

将4个无盖立方塑料箱（40 cm×85 cm×60 cm）作为容器，每个容器中盛放总质量（含壳）为750.00 g的新鲜黄蚬，并配1个循环水泵，在室温（约26℃）和自然光照下通气培养。参考冯金晓等[14]设计，以15 mg/L Na2SeO3为中等质量浓度，设置4个组，A—D组环境硒浓度依次为0（空白对照组），5，15和30 mg/L。考虑到贝类销售前的暂养期为3 d左右[14]，以及无藻类饲养条件下的存活情况，富集时长定为4 d。

1.2.2 黄蚬含水率及死亡率测定

每天同一时间随机采集30个样品，称量含壳质量，解剖内脏团、外套膜、斧足，称湿质量；冷冻干燥，称干质量，放置冰箱冷藏保存备用。同时记录各组的死亡个体数，计算死亡率。

1.2.3 标准曲线绘制

用100 μg/L硒标准溶液配制1.00 μg/L硒标准储备液和0.20 μg/L硒标准使用液；将10%HCl依次稀释成质量浓度为0，1.60，3.20，4.00，6.40，8.00和12.00 μg/L的硒标准工作液，并测荧光强度（IF）。以IF值为纵坐标，相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数。

1.2.4 标准物质的回收率检测

电子天平（德国Sartorius公司，型号BS224S）称取0.20 g国家标准物质扇贝粉，按照1.2.3节的步骤进行前处理，做2～3个重复，考察检测结果的准确性。

1.2.5 样本的总硒含量测定

电子天平称取0.20 g干样，放入聚四氟乙烯消解罐，依次加入2.00 mL Milli-Q超纯水、5.00 mL HNO3和1.00 mL H2O2后，放入MAES5微波消解仪；冷却，电热板260℃赶酸至近干，加5.00 mL 50%HCl，继续加热至溶液清亮无色并伴有白烟；冷却，移入25 mL玻璃比色管，10%HCl定容，加1 mL 100 g/L K3[Fe(CN)6]掩蔽剂，混匀。10%HCl载流液，1.5%KBH4（含0.5% KOH）还原剂，AF610B原子荧光光谱仪测荧光值IF，代入标准曲线，计算得比色液的硒质量浓度（μg/L）。样本总硒含量的换算公式：

式中：Q——样本的总硒含量，μg/g；C——比色液的硒质量浓度，μg/L；B——空白液的硒质量浓度，μg/L；M——样本的干质量，g；0.025——样本的体积，L。

1.2.6 膳食摄入量评估

膳食摄入量为满足硒元素摄入量，每日可食用的黄蚬质量（含壳质量）。《贝类净化技术规范》（SC/T 3013—2002）要求，贝类上市前可用循环水净化，时间控制为36 h左右[15]，因此参照《中国居民膳食营养素参考摄入量》（WS/T 578.3—2017）中的硒参考摄入量或可耐受摄入量[16]，采用富硒1 d的黄蚬总硒含量，计算硒元素的膳食摄入量。膳食摄入量的计算公式：

式中：U——膳食摄入量，g/d；Q——黄蚬样本的总硒含量（含壳质量），μg/g；S——人群每日硒摄入量标准，μg/d。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2019和SPSS 18.0软件，进行绘图、单因素方差分析（Levene's方差齐性检验）和单样本t-检验。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及最低检出限

硒浓度在0～12 μg/L，IF与硒浓度有良好的线性关系，线性方程为y=40.063 0 x-1.405 6，相关系数R=0.996 6。连续7次测定空白溶液，根据检出限（L）的计算公式L=3×S/k，得出最低检出限为0.67 ng/mL。其中S为空白多次测量的标准方差，k表示方法的灵敏度。多次试验的标准曲线线性R2为0.985 3～0.999 0，截距为-147.91～102.93。

2.2 标准物质验证

标准物质的回收率为83.52%～119.26%，方法不确定度UA为0.030 1。根据样品说明书，国家标准物质扇贝的参考值为（1.2±0.3）mg/kg，测定值为（0.964 6±0.030 1）mg/kg（n=12），在标准值允许误差范围内，说明该方法准确、可靠，能够满足黄蚬中总硒的检测。

2.3 黄蚬含水率及死亡率

黄蚬含水率及死亡率见表1。随着培养时间的延长，各组黄蚬的死亡率均逐步上升，含水率波动较大，无明显变化。富集结束时，D组死亡率最高。

表1 黄蚬生长指标测定结果（n=30）

2.4 膳食摄入量评估

若以蚬作为单一补硒食品，不同年龄人群可食用富硒黄蚬的含壳质量见表2。

2.5 样本的总硒含量

2.5.1 个体总硒含量日变化

富硒黄蚬硒含量呈持续上升的变化趋势，见图1。A—D组日变化均表现极显著水平（P＜0.01）。A组和B—D组之间存在极显著差异（P＜0.01）。

图1 黄蚬体内总硒含量（以干质量计）变化趋势

黄蚬在不同时间内富硒倍率见图2。由图2可见，各组富硒倍率持续升高，随环境硒浓度的增加而增加，且组间差距随培养时间的延长而加大。

图2 黄蚬在不同富集时间的富硒倍率

2.5.2 各组织总硒含量变化趋势

A—D组各组织总硒含量变化趋势见图3（a）（b）（c）（d）。由图3可见，B—D组黄蚬各部位的总硒含量明显升高，外套膜＞斧足＞内脏团（P＜0.01）。3～4 d时，D组的外套膜和斧足、C组的内脏团总硒含量下降图3（c）（d）。

图3 不同组黄蚬总硒含量（以干质量计）变化趋势

不同组织总硒含量的变化趋势见图4（a）（b）（c）。由图4可见，0～4 d，总硒含量基本都随培养浓度的增加而增加，但3～4 d的D组外套膜、斧足以及C组内脏团的总硒含量均开始降低。

图4 黄蚬不同组织内总硒含量（干质量）变化趋势①

3 讨论

3.1 黄蚬不同组织总硒含量的差异

无机硒可以通过被动吸收的形式进入细胞[17]，主要由外套膜紧邻外套腔的多对鳃实现。另外，硒可能与脂类，尤其是细胞膜上的脂类结合，而瓣鳃纲外套膜部分的脂肪含量较高[14]。紫贻贝（Mytilus edulis）和海湾扇贝（Argopecten irradians）外套膜硒含量同样高于其他组织[17]，与本试验结果一致。肌肉是动物体内重要的硒贮备库，通常以硒代蛋氨酸的形态稳定贮存[18]。培养后期，斧足的富硒倍率降低，是由于斧足肌蛋白与硒的结合趋近饱和状态[17]。

与“刺参消化道中总硒含量普遍偏高”[18]不同，黄蚬内脏团总硒含量最低。原因在于刺参消化道结构简单，消化能力弱，无消化腺，也无特化出与解毒、排泄相关的组织和器官，因此硒易在肠道积累。而黄蚬有完整的消化道和消化腺[19]，具有呼吸系统、循环系统和较完善的排泄系统（比原肾更为进化的后肾），因此摄入的硒容易被消化、利用或排泄[20]，硒不易在内脏积累。

值得注意的是，本研究仅分外套膜、斧足和内脏团，外套膜部分实际包含了外套膜和鳃。由Fournier等[13]研究结果可知，黄蚬个体富硒大小依次为内脏团、鳃、外套膜、斧足，富硒含量与经由鳃器官的总硒含量成正比，即鳃是富硒的主导器官。本研究中“外套膜”测定部分因包含鳃器官，测定结果高于外套膜硒含量。

3.2 富集时间的影响

试验中，仅D组后期出现了富硒饱和点，通过无机硒代谢途径消耗[20]，硒值下降。无机硒主要通过渗透作用进入动物细胞，最终还将达到一定平衡浓度[14，17]。由于被动运输由细胞膜两侧转运物质的浓度差决定，黄蚬在一定时间内，不断吸收环境中无机硒，并且高浓度硒环境中黄蚬吸收硒的速率快，也更早达到饱和。D组后期死亡率偏高，斧足硒值出现降低趋势，或由于过量无机硒的生理毒性[21]，损害了贮硒功能。

3.3 富硒浓度的影响

高硒培养促进富硒，出现饱和，但生理毒性[21]也影响硒贮效率。低硒培养的硒贮存效率偏低。中硒培养不仅能有效促进富硒，而且能保证斧足中稳定的硒贮存。Fournier等[2]并未观察到黄蚬个体在亚硒酸钠加富环境中的饱和状态，很可能是由于环境浓度不够高（在2 000 μg/L浓度范围内），并且暴露时间太短（1 h）。

本研究在自然条件下培养黄蚬，对培养水充氧和过滤，没有投饵和控温，而黄蚬的富硒培养还可能受营养状况、环境温度、营养盐等其他因素的影响。Fournier等[13]研究发现，在藻类密度为（0.5～10）×105cells/mL时，黄蚬个体在硒环境暴露期的滤食通气率，会随藻类密度的增加而降低。本试验黄蚬个体的健康状况因缺少藻类饵料受到限制，但暂无证据表明对硒吸收水平产生影响。

3.4 膳食摄入量评估

肉类和水产类是膳食摄入硒的主要来源[22]，摄入硒大小依次为水产类、谷物、畜禽肉类、蔬菜、水果[23]。中国居民膳食以谷物为主，蔬果为辅，因此建议增加膳食多样性，多吃水产类[24]。黄蚬富硒能力强，适合富硒产品开发。成人每日硒的参考摄入量为60 μg/d，可耐受最高摄入量为400 μg/d[16]，若以蚬作为单一补硒食品，成年人每天需摄入678.10～4 521.00 g未富硒黄蚬（含壳质量），如食用富硒1 d的黄蚬，则只需摄入28.97（D组）～75.41 g（B组）。当然，人类膳食营养是个复杂的过程，不能单一而论，有待进一步的研究。

4 结语

添加无机硒可有效提高黄蚬对硒的吸收、转化与储存水平。高浓度组，培养后期出现饱和点、甚至过饱和点。此外，硒的膳食摄入量评估结果显示了黄蚬作为补硒食品的强大潜力。在未来研究方面，可通过测定富硒过程中，硒在黄蚬不同组织存在的形态，进一步完善对富硒机制的认知，亦可从分子层面上探究黄蚬对无机硒毒理效应的应对机制。值得注意的是，补硒食品的开发利用通常涉及养殖工程和食品工程等，这也表明了多学科、交叉学科研究对于现代高质量渔业生产的重要性。